布鲁克液质联用操作规程

1、布鲁克液质联用仪操作规程1操作前检查1.1 检查液氮罐和高纯氮的出口压力，保证在正常范围1.2 检查洗针溶液和流动相1.3 流动相须现配并超声，缓冲盐溶液过0.22口微孔滤膜（或者使用色谱纯的盐溶液和酸溶液）1.4 如使用溶融石英进样管，操作前应检查石英管是否拉长，确保其未超出ESI探针尖端。1.5 检查系统真空度，电离真空计读数（分析仪区域）应小于 5X 10-6 Torr。1.6 检查废液液位，及时清空废液。1.7 检查液氮罐和氯气钢瓶是否有一定压力，以便为测试样品提供符合流速和压力要求的氮气 （喷雾气体和干燥气体）和氮气（碰撞气体）。2操作步骤及注意事项1 .检查并打开干燥气 （Dry

2、gas）和雾化气（Nebulizer Gas）所需的氮气源；1）如配备液氮罐，则需打开增压阀及供气阀阀门，使罐体压力保持在100 psi以上，并调节减压阀出气口压力至 0.6 Mpa ;2）如配备氮气发生器，则提前半小时打开氮气发生器电源，以便使氮气能够达到99.99%以上的纯度，再调节氮气流量至20 L/min ;2 .检查并打开碰撞气 （Collision Gas）高纯氮气N2或高纯僦气 Ar钢瓶（纯度要求 99.999%）,并调节减压阀出气口压力至0.4 Mpa ;3 .检查机械泵泵油的水平线，需在小窗口的1/22/3之间；4 .打开计算机，显示器电源；5 .打开质谱仪主机电源（仪器左侧

3、最下方）6 .启动micrOTOFcontrol 控制软件，务必保持仪器一直处在shutdown状态，待真空度达到< 1x 10e-6mbar后，才可切换至standby状态待机；为了保证良好稳定的实验结果，待真空度下降至 10e-7mbar以下后，再operate仪器开始测试。2.2 新建液相方法打开hystar软件，选择method,然后输入新建方法的名字，点击open,开始方法的新建。在弹出的对话框中选择edit ,然后点击“ wizard ”进行设置。液相方法包括梯度、流速、柱温、样品盘温 度、时间、进样针吸样速度等，可依次设置即可，全部设置好之后，将。2.3 新建质谱方法方法一

4、：在otofcontrol 中，打开method,按照自己待检测物的分子量范围及正负偏向性选择合适的质谱方法，小分子有对应的small molecular 方法，蛋白质组有专门的proteomics方法。方法二(非专业人员不推荐)：在otofcontrol 中，打开method,选择new/,即可新建质谱方法。可以修改的参数包括以下几个方面：(1) mode 中的 Focus 为 active , line spectra calculation 为 use sum intensity , ion polarity为pos或neg, mass range调到待检测物合适的分子量范围。(2) s

5、ource 中 capillary pos： 4500V, neg： 3500。Divert valve : source1-2 进质谱；source1-6 为 discard to fluid(3) Tune中collision RF小分子调到1000-1500,大分子调到 2000-2500; low mass视目标物分子量大小截留(例如目标分子为500,可调为300,去掉小分子区域的杂峰)。(4) MS/M汕如果想检测二级，可以勾选auto MS/MS ; precursor ions 中cycle time 正常下为3s(5) chromatogram 中选择 BPC根据待检测物的分子

6、量大小和正负偏向性，先在软件自带的质谱方法中选择相应的方法，再在此方 法的基础上进行优化及分段(如含盐的样品截掉前2-5分钟，1-6 waste )。仪器在操作状态下Operation稳定20-30分钟后即可开始仪器质量准确度校正。2.4 仪器质量准确度校正2.4.1. 药物和酶解多肽样品，选用甲酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围m/z 90-1200 ;校正模式选用Enhanced Quadratic。2.4.2. 蛋白质类样品选用三氟乙酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围m/z 200-2000 ;校正模式选用Quadratic。2.4.3. 校正液配制甲酸钠校正液：溶剂：异丙醇：水溶液

7、=1:1并含有0.2%甲酸10mM甲酸钠校正液： 1ml 1M NaOH + 99ml 溶剂三氟乙酸钠校正液：溶剂：50%乙氧含有0.1%三氟乙酸钠(TFA)2.2.3.Calibration 校正界面word教育资料3 .测样方式3.1 直接进样测定如果仅需要进行鉴定， 可以采用直对于标准品或相对较纯或混合组分较少并且不含盐的药物样品,接进样方法测定。3.1.1 样品用标准溶剂（50%HO, 50叱睛或甲醇，0.1%甲酸）溶解或稀释3.1.2 将配好的样品或标准品吸入进样器（针），将进样器（针）放置于进样泵中。注意：进样器（针）内不能有气泡3.1.3 将进样器（针）直接与离子源连接（如图）团

8、UrkrFnp="=nrmffy注意毛细管与注射器之间需紧密连接。进样器内不能有气泡3.1.4 设置进样泵的流速为 120180微升/小时。3.2 液质联用（LC/MS）测定样品采用常规液相色谱系统 （色谱柱2.1x150mm；流速200-300uL/min ）。启动Hystar软件，打开hystar 软件，在sample table中选择相应的文件并打开，然后复制一个之前做过的样品，对复制后的新的 一行进行文件名，存储路径和液相质谱方法的修改（改完之后再检查一遍）。注：如果是新建sample table ,可以打开一个新的复制一行粘贴到新建里，因为新建的自动进样的 不对。样品表编辑

9、界面General*逅叫七二：* r- fa- LB I h ，二尸样制表以Emi表拾式列出，界面钱浩;/支持Windows常用的制、粘贴等多令,方便修改;1*I* U - - _ , "tl.担保存路样品表编辑界面-MethodsMsfwdPlsii虑择液间方法选择用港方承Wx51"灌相厅斌嫁颗、DMhnM.Mild_才Edi3 tdi-的每个样晶.可分期区用不同峋滥相本法.履方法，依神曲理方法等等1,建议不同地料的方法，如而相方挂.马附方法等，分别保存在不同的蹄桂下."可以将所行方就合并保存.4.jASup»r mgthodp如第二班中可调用的方越士

10、*廉谓方法的编辑在micrOTOFentrM中.幅辑好后保存为夙酒方池文件,11ym冲 只选第用文件:HM* (MHKn»Ox系统控制和状态区亭'Ml* fAnyMntlii.il iemF寸F&b，J3TE d<H IL ,4iG3C1 Hpl Jl.SH J当前样品宿泉*分程块显示.液相精就泵、进乾靠、杆磊籁.带疆界等).虐漕第蚯畀:k眼液相+控网命令在棚双模坡的右健菜单中时于。01»工液相和Wa忸e.可进入其自身的控制软件界面1，液相控制和揉柞清警写液相亲统说明* ky科时状态MM示为暴色时，表示所君系统稚粉就绪可开始聚集歌据;点击FtarF开始

11、效掘枭集Bnj-kET DattcMndEx数据采集怩昼使用批阜采集可更混活、方便的福加丽除样品auMr n忖门，看采集结束后的系统设置择“Bmktrs4 .输入下列参考参数4.1 直接进样：(低流速)大约在 120 180微升/小时离子源：Nebulizer 0.4 barDry Gas 4.0 L/minDry Temp 180 C4.2 药物小分子样品液质联用：平均流速大约在200-300 uL/min离子源： Nebulizer 0.8 barDry Gas 6-8 L/minDry Temp 180 C4.3 酶解多肽样品液质联用：平均流速大约在200-300 nL/min离子源：D

12、ry Gas 3.0 L/minDry Temp 160 C5 .手动获得一个MS/MS图谱打开 MS/MS 界面，选择 MRM-> 输入Parent Condition 列表，激活 Scan Mode。6 .后期处理6.1 打开分析文件6.1.1 在任务栏中或者在工具栏中选择按钮均可切换到数据分析程序(DataAnalysis)，读取所获得的数据文件6.1.2 读取数据文件被可选择File 菜单下的open对话框，所需要的显示窗口将被程序自动打开。6.1.3 在文件对话框中选择目录d:datastart用鼠标键双击test0000.d , test0001.d ,test0002.d来

13、打开数据文件；按住 shift键来标记所有文件并点击回车键来一次全部打开所选文件。6.1.4 质谱图与色谱图按文件名读取并显示在File菜单下。在分析清单窗口下选择所需的文件，选择后图谱在各自的窗口下显示。6.2 质谱图6.2.1 在分析清单窗口下选择的结果在质谱图窗口显示。6.2.2 通过Masslist参数对话框改变离子检测参数6.2.3 下列对话框被用来在图谱中设置新的离子检测参数6.2.4 对下一步的 Method 参数设置参见 Bruke Daltonics DataAnalysis Reference Manual6.3 色谱数据6.3.1 完整色谱图1 .读取数据文件(e.g.

14、test0001.d ),显示 TIC ( Total Ion Chromatogram )2 .读取某一个离子的色谱数据可以打开Edit Chromatogram Traces 对话框3 .通过Edit 菜单下选择Chromatogram 选项来打开 Traces 对话框 如下图所示，选择质荷比为622的离子。6.3.2 获得各组分的质谱图(Compound spectra )使用Find - > Compound功能键，快速有效的产生各组分的质谱图；1 )功能键 <Compounds-Chromatogram>产生色谱分离过程中所有组分的质 谱图。打开 Compound

15、Spectra 窗口时，可以看到各组分的质谱图。2)功能键<Compounds-MS(n)>产生所有采用 MS(n)步骤采集的图谱。3) <Compounds-AutoMS(n)> 产生 MS-和 MS/MS 图7.报告有几种可用的报告形式来输出数据，一种报告仅有质谱图，另一种报告则只有色 谱图，还有一种两种图谱都保留。7.1 .直接打印：打印键 ；或者打开File 菜单，选择Print ;或者通过打印 预览打印，选择打印预览键或在File 菜单选择Print Preview ,然后在打印预览窗口下选择打印键7.1.1. 告内容下拉菜单包含了所有可选的报告内容7.1.2

16、. 获得参数报告选择此内容的报告中包含了获得所选分析结果的参数7.1.3. 显示报告选择此内容将完全按照显示窗口打印(包括色谱窗口、质谱显示窗口、混合 物质谱窗口、质谱窗口)7.2 质谱图报告内容中几种可选的质谱图形式7.2.1. 质谱清单报告报告中含所选的质谱图的peak清单7.2.2. 质谱图报告报告中含所选的质谱图报告7.3 色谱图 报告内容中几种可选的色谱图形式7.3.1. 色谱清单报告报告中含所选的色谱图的色谱峰清单7.3.2. 色谱图报告报告中含所选质谱图的报告7.3.3. 混合质谱图报告 报告中含所选色谱图的混合质谱报告“城"Valve废液模式（不含定量环）Divert

17、 valve In soorce posit ion* groon (HPLC to yolli>A (nobuhzer).* blue (caHbrsrt)窜曰 loop to gray wasie)Divurt valve in waste pcsilion:* green HPLC) is connected to gE, (waste)。HPLC (low is nd oim心田口 to source (this 店 jeIuI for flushrcf HPLC er column.* bluo (calibrant)电 ccnncckxi tc yolitiw (nebuli

18、zer.Conclusion： no constant flow, flow rate is dependent on valve position(HPLC flow <-> syringe flow), calibration can be done in micrOTOFcontrof software or in post processing soitware. valve can be used for switching HPLC flow directty to wiste. syringe pump can be used for infusions.B R t/

19、KE Rr L-tiumti nrlXT kna Tira啊IMLTOXfGS多级质谱：Auto MS/MS适用于定性 任切 ModF 卜3 Solko* f ' 1SA1S 肃 Sancte into 4 ChionMoo«r 给匚号蒯制.* irtfrunefir Tuw 皆 Sflrca PtccuriDi ioniThcihio4d3 m AbtoMs ALU d*RNafig 。*SmM Ex由4*X1国 ACttw | S | Acflfve ExcKisori叵 AtSvqEdde&ter 3 5pvctr«Hetearc ater 1 00 mn Auto MS/MS页面可定义自动二维履谐相关的数据聚集策略;F Smart Exclusion会自动棒除强度不变的背景】，动态揖除是增加数据最：根据实际胃景寓于添加相应的排除离子，,根据实际背景（基线）褊定绝对信号强度的税值.方法编辑区MS/MS页面；MRM "逅* ? Hwte Sovce