耐药基因型检测

1、作业指导书第1页共4页文件编码：第1版第0次修改文件名称：耐药基因型检测操作规程作业指导书公布日期2007年01月07日耐药基因型检测操作规程作业指导书1目的本操作规程是关于使用in-house方法进行耐药性检测过程标准操作和结果 分析保存的规程.2 适用范围适用于HIV-1耐药基因型测定.3 责任在使用in-house方法进行耐药性检测过程中,研究人员必须依照本标准操 作规程进行操作.4 作业程序4.1 核酸提取：推荐使用 QIAGEN 公司 QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取 RNA.4.2 引物4.2.1 扩增引物第一轮PCR:外侧上游引物 MAW 26 : 5&#

2、39;-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3' HXB2 2028-2050外侧下游弓I 物 RT21 : 5'-CTGTA TTTCTGCTA TTAAGTCTTTTGA TGGG-3' HXB2 3509-3539第二轮PCR:内侧上游引物 PRO-1 : 5'-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3 ' HXB2 2147-2166内侧下游弓I物 RT20 : 5'-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3 ' HXB2 3441-34624.2.2 测序引物正向测序引物：PROS3 : 5'-G

3、CCAACAGCCCCACCA-3 'RTAS : 5'-CTCAGA TTGGTTGCAC-3 'RTBS : 5'-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3 ' HXB2 2946-2967 反向测序引物：PROC1S : 5'-GCTGGGTGTGGTA TTCC-3 'RT20S3 : 5'-GTTCTAGCTCTGCTTC-3 '参照国际标准株 HXB2株(全基因1-9719bp) POL基因序列(2253-5096bp),其中 蛋白酶(2253-2549bp),逆转录酶基因(2250-4229bp),整

4、合酶基因(4230-5096bp).我们所 使用的方法扩增产物长度为 1.3kb,包括蛋白酶基因全长 (1-99 codon)和逆转录酶基因前 300 个氨基酸(1-300 codon).4.3 准备RT-PCR 逆转录及第一轮PCR反响体系：在PCR准备间平安柜 内进行,注意配置过程应在冰上进行.推荐使用 Takara One Step RNA PCRKitAMV,总体系256,见下表：反响数1410162410*buffer2.510254060 1MgCl25205080120dNTP2.510254060MAW260.525812 nRT210.525812RT0.525812 taq

5、0.525812RNase Inhibitor0.525812ddH2O7.53075120180 1template54.3.1 将除酶以外的试剂取出置于室温,待其溶化后震荡混匀5秒钟,短暂离心后置于冰上备用.4.3.2 酶及逆转录酶抑制剂取出置于冰上,使用后立即放回-20C保存.4.3.3 准备PCR管,管身标记清楚编号,置于冰上备用.4.2.4使用1.5ml离心管配制 RT-PCR反响体系单位 小,按每管206将配制好的反 应体系分装至PCR管中,注意将液体加至管底.4.4 RT-PCR 逆转录及第一轮PCR4.4.1 将分装好的PCR管拿到加样间,分别将样本 RNA、阳性对照样本 RN

6、A及阴性对 照样本RNA各56参加相应PCR管中.注意不要发生交叉污染.4.42将混合物混匀并短暂离心后放入PCR仪中,设定程序：50 C 30分钟；94 C 5分钟；94 C 30 秒,55 C 30 秒,72 C 2 分 30 秒,30 cycles ;72 C 10分钟,4C 保温.运行程序.4.5 第二轮 PCR4.5.1 在PCR准备区配制反响体系,注意配置过程应在冰上进行.推荐使用TakaraPerfectshot TM Ex Taq Mix ,总体系 50l,见下表：反响数14101624Mix25100P 250400600PRO-114101624RT2014101624dd

7、H2O1872180288432template54.5.2 反响体系的配制同 RT-PCR.体系配制完成后,根据每管45.将配制好的反响体 系分装到PCR管中.4.5.3 将分装好的PCR管拿到加样间,将第一轮反响产物各 5 6参加相应的PCR管中,将混合物混匀并短暂离心后放入PCR仪,设定反响程序：94 C 5分钟；94 C 30 秒,63 C 30 秒,72 C 2 分钟 30 秒,30 cycles ;72 C 10分钟,4C 保温.运行程序.4.6 PCR扩增产物电泳鉴定4.6.1 于三角烧瓶中称取1g琼脂糖,参加100ml 1XTAE溶液,配成1%的胶溶液,置于 微波炉中,中火加热

8、 3分钟,冷却到60c左右时参加5ul 1%的EB溶液混匀.4.6.2 洗净的电泳板和梳子擦干,倒入溶胶液,使胶的厚度到达0.5cm左右.室温下放置至少40分钟以上,使胶彻底凝固.4.6.3 待胶凝好后缓慢拔出梳子,放入电泳槽,倒入 1XTAE,使液面高出胶平面1mm左右O4.6.4 取第二轮PCR产物5ul缓慢参加电泳孔中.假设反响体系中不含 Loading Buffer那么 于玻璃纸上滴点10 X上样缓冲液,每滴约 1ul,取第二轮PCR产物5ul与10 X上 样 缓冲液液滴混匀后缓慢参加电泳孔中.同时在电泳孔中参加5 ul分子量为2000的Marker,判断PCR扩增产物的正确位置.4.

9、6.5 电泳仪电压设量为 100v,恒压电泳,40分钟左右观察结果.4.6.6 将电泳后的胶从胶板上取下,置于紫外透射反射仪上观察电泳胶中期望的PCR产物条带并拍照.4.6.7 挑取PCR阳性样本用于扩增产物的纯化回收,同时应该暂时保存第一轮PCR产物-20C以备必要时进行再次扩增.4.7 PCR扩增产物纯化此步骤用于将PCR产物纯化并回收,用于回收的样品应经电泳检测无明显拖尾,并且有足够的浓度,回收的样品 DNA也应符合无明显拖尾、杂带的标准才可用于测序.4.7.1 方法如上配置2%的琼脂糖凝胶,使胶的厚度到达1cm左右.室温下放置至少 40分 钟以上,待胶彻底凝固后将剩余45ul PCR产

10、物全部参加电泳孔中.于剩余45ulPCR产物的PCR管中参加10X上样缓冲液5ul,混匀后将第二轮 PCR产物全部加 入电泳孔中.4.7.2 PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳,恒压100v 1小时具体电泳时间以将目的条带和其它 混杂条带分开为准.4.7.3 用干净的手术刀将含有 PCR产物的琼脂糖凝胶切下置于1.5mlPCR管中,胶块重量控 制 在0.1克左右.注意在切胶时应在胶下铺一层 PE手套,以预防刀片损坏紫外灯.4.7.4 称量胶块的重量,然后依据 QIAquick Gel Extraction试剂盒操作说明进行纯化.4.8 测序4.9 序列结果贴网分析Stanford HIV Drug

11、Resistance Database使用规程4.9.1 直接进入 Stanford Hiv Drug Resistance Database() ,图 1.点 击HIVdb ,进入下一界面(图 2).St曰nfond HIV Dug Resimtance Dat己baseAMtri? > uhllih*d HIV ffT %0 MUuK* Amifeudinq »w*u11ww iftd dnif-nliriM! wIhUma Ih Um flirulir cf mII-HIV ebtnL卜的e电AuJy0K叼口封福父.邓gW*WE*引才c

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27、e file selection box below标题下的浏览框选择所要分析的序列所在文件夹,选中文件名,点击翻开或者将测序好的序列文本格式粘贴 在此界面下方text box里,点击Analyze进入下一界面图 4.3 RITdbf Drue RuianNuujci A1eDrilka： E«t. To9To - MicE<£ioft InioaznDt Ecploror'苫X.切.口 W国小/?* 一加电叫0 >9址atitp" uf ard 卡我f 二nf dpHtLki jumctLtQ m用ECru)=bni>'h3 .

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30、 Quality Assessment ,上表对所测得 序列PR基因包含1-99个密码子和 RT基因包含1-248个密码子的序列进行三个方 面的质量评估： Stop Codons 终止密码子和 Frame Shifts 移码突变； B,D,H,V,N:如果产生在耐药位点,用GCG 软件包或Bioedit软件进行序列比对分析,对照测序胶图比拟是否在此位点出现重叠峰,这有可能是体内野生株和突变株共存； Unusual Residues非正常碱基.4.9.4 续上图图 5,此界面显示一个 PI Drug resistance interpretation 和

31、 PRComments .此界面说明了产生的针对蛋白酶抑制剂相关耐药位点和耐药的程度.例如：该序列分析结果说明这个病人接受了抗蛋白酶抑制剂 PI的治疗,产生蛋白酶抑制剂主要耐药突变 PI Major Resistance Mutations ,有三个突变位点, 分别是I54V、 V82A 和L90M .产生蛋白酶抑制剂次要耐药突变 PI Minor Resistance Mutations ,有 五个突变位点,分别是 L10I、D60E、L63P、A71V、I93L.3|Driif Resistance Al£,n>r:it3个才温 TrjitJ - VicrrtainiTt

32、Tritn：rraet Expl文怦/ 用箱凰 菱:者的 掇I® ZAO 帮助Q.题国曲心 户?曲/e"钻宣j金I二Q kLlp y/kiN坪命mMAil,业过学id/hkf曲1/e白行g=Liv品1耽il =Drug Resist到nt e IMerpr时atiunPl kkWi r已到咏皿足痴工滞风的 iwv.邮?丸LHOMPl Win* RwtolMi Mmflg; LWL DHEP L5JP. A7TV, B3LPR OHiei M用刚历iK14R, R41K. E4VlihlhiliitoisAPV HlErme蚓e distanceA TV iniermfiit

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36、p; commw n sow non-B subtypes, h haw liltlB if any 弛以 on PI susceptibilHy. L9QM 0峙g resistance to SQV and NFV. When 目布舞nt with Qthr 而址就h 曲轴 empMrm与解 the ac1 说y of IDV. filV,即优 LlPV. andATV. B3L is a common polyrnorphiEni 1hat is -associatBdwilh iresistwice to PIe Men present with other0ug Re5©3

37、fe ntEFE:己lien. 下七一M稔曲£1世ch 1 MHttsaFU - lie.当m葩feeRf二前曲名-国.百3.打维臬 儆的4.9.5 续上图图 6,此界面显示一个 NRTI and NNRTI Drug resistance interpretation 和 RT Comments.此界面说明了产生的针对逆转录酶抑制剂相关耐药位点和耐药的程度.例如,序列分析结果说明这个病人同时也接受了抗逆转录酶抑制剂的治疗,产生核昔类逆转录酶抑制剂的耐药突变NRTI Resistance Mutations ,有四个突变位点,分别是D67N、K70R、T215F、K219Q.未产生非

38、核昔类逆转录酶抑制剂的耐药突变NNRTI Resistance Mutations .J KTTfih: Drug： Resist an>fi£ Al (nr it ha (Bet» T nst) Vi qja nsnf t Jnt ernct Explorer宽伴 揖辑整 查者皿 收承® Tfiil 第购.硼- O 9 B6 P«也但看网色处&Mi & *A.力"匚 I0 省 /havdb4. Si-Uliat'd.虱u/idlf 也910?4%.亡血匕 tl. ylprgrvdb&ic Lj 电3fhe

39、m以用电球d"唯Drug Resistance InterpretsitionNRTd Reahtiihfe祝山命加D«7H. K70R. T215F. K21DOHHRT1 R*sret.iirit« Murt.tifliire;NnneRT Othar Mirtatlirg：K32N, T39A, SBAS, D121YB K122E. I195K K173Q. H7BL.V2柘QMdicklde RTIiNkiw-Kd-slide RTI1TCSgceptib 拒DLVStisceplibleABCIZemiEd闻怕 ro«isl-anc«

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44、tion Scoring4PV/VNIDVLPVNFVRIVSQV3TCABCfiZT D4TDDCDDIDLVEFVFTCNVPTDFL10I22N2222D67NoWIS12£5aQ| 5I54Vin10|1O12西10IflK70R0n-135550_5D6OE _r-P15FQ20'aS的1212-0DL63P2| 22' 22T2K219O0ID18125-05A71Vq4T3444T Dtal:045eg542727000025V82AIQ2D英183535RiFL90M| IS四圆坦5Q四3519311111111TqM4459744B1097H6JHo

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