南海海洋微生物混合培养标书

1、 项目编号：广州中医药大学中药学院课题设计大赛 申 请 书 项目名称 一种南海软珊瑚共生菌的抗肿瘤菌株的筛选及其培养条件优化的研究字太多，控制在25字以内。 项目负责人 专业班级 指导教师 单 位 联系电话 申请日期 项目类别： A 中医药类 B 社会科学类广州中医药大学中药学院二O一一年 四 月 作品名称 一种南海软珊瑚共生菌的抗肿瘤菌株的筛选及其培养条件优化的研究项目负责人性 别出生年月学 历（）A本科生 B 大专类别（）A个人作品 B集体作品学 院专业年 级学 制入 学时 间指导老师学号联系方式合作者情况姓 名性别所在单位（学院、专业、年级、学号）学历年龄作者签名此项删除摘要（限400字

2、）目的：从一种南海软珊瑚共生菌中筛选出一株抗肿瘤活性最强的菌株，并利用正交实验法优化培养条件，以提高次级代谢产物含量和抗肿瘤活性。 方法：用不同抑菌剂将软珊瑚共生菌进行分类培养，纯化分离出海洋细菌、放线菌和真菌，用MTT分析法对各培养液进行抗肿瘤活性测试，选择一株抗肿瘤活性最高的菌株，采用分子生物学进行形态鉴定，并命名为“ZZCL菌株，同时采用正交实验法对其培养条件进行优化设计。对发酵产物运用萃取，薄层色谱，正相、反相硅胶柱色谱等化学分离纯化手段进行分离，继而利用理化性质和波谱学（UV、MS等）等方法确定生物活性物质的化学结构。结果：通过实验筛选出了抗肿瘤活性最强的一株菌株，同时确定出产生物活

3、性物质的化学结构及最佳培养条件。并非已有结果的正式论文，所以不用四段论。项目的立项依据（附参考文献）研究意义与存在问题肿瘤是细胞异常增生所形成的，目前全球每年的癌症（恶性肿瘤）患者达1270万人，癌症死亡者为760万人。俨然，肿瘤已成为当今严重威胁人类健康的重大疾病之一。近年来，抗肿瘤药物的发展进入了一个新的阶段，由天然药物的开发发展到了新靶点抗肿瘤药研究以及基因疗法等，随着临床应用的进一步扩展，肿瘤的药物治疗将在未来一段时间内得到更大发展1。而海洋微生物中许多结构新颖、活性独特的物质,因其很多具有抗肿瘤活性，备受科学家的重视。海洋生物活性物质的研究是自20世纪60年代开始，然而海洋微生物活性

4、物质的研究相对比较缓慢，只有零星的来自海洋微生物的活性物质被报道2，对软珊瑚的研究也有同样的情况，大部分研究还是针对其体内的次生代谢产物。另外，现有的研究较少有探讨培养条件的变化对生物活性物质相关作用的影响。故本文选取一种南海软珊瑚，分离纯化其共附菌，筛选出抗肿瘤活性最强的菌株，并用正交试验确定最佳培养条件，更好地挖掘出海洋微生物分离抗肿瘤活性物质的潜力，进而通过分子生物学和化学等方法确定化学结构式，丰富海洋微生物基因库。肿瘤病国内外研究现状分节好些。肿瘤是一类古老的疾病，早在2000-3000年前，国内外已有关于肿瘤的记载。肿瘤是细胞异常增生所形成的，根据肿瘤的生物学行为可以分为良性，恶性及

5、交界性肿瘤，良性肿瘤一般生长缓慢，与周围正常组织之间有明显的界限，常有完整的包膜，也不向外扩散侵入正常组织，不会发生转移，仅对周围组织产生挤压，通常预后效果较好，一般不会导致患者死亡，而恶性肿瘤生长迅速，呈浸润性生长并侵犯周围组织，瘤体质地一般较坚硬，多无包膜，常会发生血道和淋巴道的转移或者种植于胸腔、腹腔及盆腔等处，手术后常会复发。生物学介于良性和恶性之间的肿瘤为交界性肿瘤，我们常说的癌事实上是恶性肿瘤的一种，在社会生活中，是所有恶性肿瘤的俗称和统称，医学上指的是上皮组织的恶性肿瘤，约占恶性肿瘤的90%，另外一种恶性肿瘤是肉瘤，它来源于间叶组织/淋巴造血和神经组织等，约占恶性肿瘤的10%。肿

6、瘤的产生和发展是一个多因素作用，多因素参与，经过多阶段才形成的生物学现象，不同的研究阶段提出了不同的学说。目前为止，被学术界肯定并沿用的学说主要有三阶段学说、两次突变学说、多阶段学说和干细胞起源学说。不过近些年研究比较多的是肿瘤干细胞理论，也有研究证实，正常组织器官存在一定数量的干细胞，它具有潜在的自我更新和分化能力，而正常组织干细胞与恶性肿瘤细胞有着极其相似的生长调控机制，肿瘤的发生与组织干细胞有着密切联系，并认为肿瘤细胞源于组织干细胞恶性转化。有研究发现，肿瘤除了具有一定的异常因素外，人类80%-90%以上的癌症与外部环境因素也有关，即人类生活环境中的物理、化学和生物因素与癌症的发生密切相

7、关。目前，已有不少恶性肿瘤可能通过化学治疗痊愈，如恶性淋巴瘤，睾丸生殖细胞肿瘤，滋养叶细胞瘤等能够通过化学治疗获得根治性疗效。另外，近些年来肿瘤的抗血管生成治疗、肿靶向治疗、肿瘤热疗及肿瘤的生物治疗也为肿瘤的内科治疗提供了多种手段 3。在抗肿瘤药物的研究上，海洋微生物因环境特异，形成特有的代谢途径和机体防御机制，其产生的代谢物的化学结构具极大的复杂性和多样性。这就为从海洋微生物及其代谢产物中筛选和提取具有特异化学结构的天然活性物质提供了极大的可能性。近几年来的研究表明海洋微生物提取物中至少有10%具有细胞毒活性，美国每年有1 500 个海洋化合物单体被分离出来,其中1%具抗肿瘤作用4。从海洋微

8、生物中筛选抗肿瘤活性物质是当今“向海洋要新药”的热点之一，这也为延长患者生存期、提高生存质量提供了更多的方案。海洋微生物及其培养条件优化的研究现状一般认为，海洋微生物是分离自海洋环境，需要在仿生条件下才能正常生长环境，但现在更为科学的认识是，其生长不一定需要海水，但可产生不同于陆地微生物的代谢物( 如溴代化合物抗生素) 或拥有某些特殊的生理性质( 如盐耐受性、液化琼脂等)。因此海洋微生物包括海洋中生物起源的种类，又包含陆地起源后流入海洋中并适应了的微生物种类，因此，海洋微生物几乎包括了所有的现有微生物种类。海洋微生物与陆地微生物有着很大不同。海洋中寡营养的条件，迫使许多海洋微生物与富含营养成分

9、的海洋动植物共生, 以获得生存必需的营养,这种现象在海洋微生物中很普遍并具有很高的特异结合选择性。微生物物种之间争夺宿主的竞争也十分激烈, 导致很多微生物通过代谢产生一些小分子有机化合物来争夺有限的营养和进行自我防御,而且由于生存环境的原因, 很多海洋微生物次生代谢产物的化学结构、生物活性均与陆地微生物有明显不同, 这些化合物是海洋微生物次生代谢产物作为新药药源的重要基础5。研究认为，海洋微生物有五类基本代谢物：胺及酞胺类、吲哚生物碱类、乙酰配基类、环肽类、聚丙酸酯类, 其生物活性包括抗菌、抗肿瘤、抗微生物、抗病毒、酶及酶的抑制活性等，抗肿瘤活性是其中的一个最重要方面6。在代谢产物提取分离等技

10、术上，传统的液液萃取分离技术成本比较低、易于运作，仍广泛应用于多组分物质的分离。但由于溶剂的局限性，难于分离大分子生物活性物质。因此，一些新的萃取技术如超临界流体萃取技术、膜分离技术超和临界流体色谱等应运而生7，虽然对海洋微生物生物活性代谢产物的分离提取和研究提供有力的技术支持，但据估计，目前只有不足5 % 的海洋微生物可以培养鉴定，已发现的活性物质只占总数的1% 8，所以如何提高提取分离和鉴定的技术，也是当下应解决的重点问题。随着生物技术的迅猛发展，微生物对工业、农业、环境、医药、食品卫生、畜牧、兽医等事业发挥着越来越重要的作用。由于各类微生物对营养有不同的要求以及微生物培养用途的不同，促进

11、了微生物培养的研究、生产、使用技术的不断改进。但是发酵过程机理复杂，影响因素众多，菌种的生理生化特性及发酵的工艺确定后，适宜的培养基配方成为发酵水平、原料成本高低的决定因素而一般的培养基种类繁多，各成分间的相互作用错综复杂因而，微生物培养基的优化工作就显得尤为重要，对于培养基的优化有一些比较成熟的方法，如单因素法、正交设计试验法及响应面分析法9，其中正交实验法以其试验次数少、考察因素多、水平合理、分布均匀等优点成为实验室常用方法。为适应实验的需要，研究者不断开拓新方法或采用不同方法交叉对培养基进行优化，这为特定目的的资源菌株或特定环境的资源菌珠的分离和批量化生产提供更多选择。 海洋微生物抗肿瘤

12、的研究在肿瘤治疗中，手术治疗、放疗、化疗是最传统的3种治疗方案，其中化疗占据着不可替代的重要地位10，因此对化疗药物的研究，成为抗肿瘤的重点问题之一。常用的抗肿瘤药物有烷化剂类、抗代谢药、抗生素、植物药、激素及内分泌类药物、杂类、生物治疗药物、中药类单方、中成药、海洋药物等11。海洋生物的天然活性产物因其正在不断地为抗肿瘤新药的研究与开发提供大量的母核结构和药物前体，成为学者预言的最有前途的抗肿瘤药物，而海洋微生物在此领域有着巨大的潜力。目前已从海绵、海鞘、海兔、海藻、海苔虫、鲨鱼、珊瑚以及海洋微生物中分离出2万余种天然产物,其中不少化合物显示出明显的抗肿瘤活性, 一些化合物已被作为抗肿瘤候选

13、药物进入了临床前或临床研究阶段12。软珊瑚是其中一个重点开发物种，研究表明软珊瑚大部分都含有丰富的化学物质，其分离出来的化学物质已经被证实能抑制癌细胞的增长，具有作为天然药物的潜力。随着海洋中微生物新种的不断发现及分离到的海洋微生物代谢产物逐年增多，海洋微生物尤其是海洋细菌作为活性物质的新来源正日益受到国内外海洋工作者的重视13。据统计，在海洋动、植物体表附生及海洋动物肠道内的细菌数量比真菌和放线菌的数量高1-2个数量级。同时，海洋细菌产生的生物活性物质的种类也最为丰富，有抗菌素、抗病毒和抗肿瘤物质、毒素、酶类、多糖、酶抑制剂等14-16。虽然海洋生物蕴藏着重要且丰富的资源，但目前人们对海洋生

14、物的认识仍相当有限，利用率仅有1%,而且更大部分是对海洋生物活性物质化学成分的研究。综上所述，海洋微生物虽然以抗肿瘤药源之一成为研究重点，但其研究技术还不够成熟，相应的培养条件还需进一步优化，尤其是缺乏对海洋动植物体共生菌的次级代谢产物和培养条件优化的研究。因此，本课题将从众多科学家认为较有研究意义的软珊瑚共附菌中分类培养出海洋细菌、真菌、放线菌，寻找一株抗肿瘤活性最强的菌株，并通过正交试验探讨培养条件的优化对其抗肿瘤活性的影响，同时提取分离并确定生物活性物质，不仅为肿瘤病提供新药源，也丰富海洋微生物基因库。参考文献：1 唐永刚.抗肿瘤药物临床应用现状与研究进展J. 药学专论,2008 ,17

15、（7）：1-22 詹萍，梁静娟，庞宗文产生物活性物质海洋微生物的研究进展J玉林师范学院学报，2007，28(3)：71743 华东. 如何正确认识恶性肿瘤J.抗癌之窗, 2012, 2 (2 ), 40-44.4 陈钢，朱卫.海洋微生物抗肿瘤活性物质研究进展J. 浙江海洋学院学报, 2008，27（3）：322-324.5 王 幸,吴文惠,陈志华,等.海洋微生物次生代谢产物的结构特征和生物活性的研究进展J.中国天然药物, 2010 ,8(4)：309-311）.6 胡艳红,张庆林,王正平.海洋微生物生物活性代谢物研究进展及技术问题J.科学技术与工程,第2004,4(2)：160-162.7 张

16、奕婷,迟海洋,张丽霞,等. 海洋微生物活性物质分离提取方法研究进展J.2010,30(6)：121-124.8 Knight V.Sanglier J J.Ditullio D,et al.Diversifying microbial natural products for drug discovery.Appl Microbiol Bitechnol ,2003,1-28.9 SAUDAGAR P SSINGHAL R SOptim ization of NutritionalRequirements and Feeding Strategies for Clavulanic Acid P

17、roduc·tion by Streptomyces ClavuligerusJBioresour Technol，2007，98(10)：2 0102 01710 巫蒙,王梅.肿瘤多药耐药性产生机制及其逆转的研究J.现状当代医学,2011, 17(21) ：26-27.11 刘因华. 抗肿瘤药物的研究现状与发展前景J.中国医药指南,2007 , 6(17)： 105-106.12 连炜,叶波平.海洋天然抗肿瘤活性产物的临床研究现状J药学进展，2009, 33(5) ：24 . 13 郑立，林伟，严小军，等海洋细菌抗菌和细胞毒活性的初步研究J应用生态学报，2004，15(9)：163

18、3一l63614 詹萍，梁静娟，庞宗文产生物活性物质海洋微生物的研究进展J玉林师范学院学报，2007，28(3)：717415 孙倩，洪葵海洋细菌生物活性物质多样性0海南省生物工程会2005年热带亚热带微生物资源遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集，三亚：海南省生物工程协会，2005：36-4116 吕家森，黄惠琴，丛明，等一株海洋细菌的鉴定及其活性物质的初步研究J海洋学报，2006，28(5)：173178研究目标针对这两字精简。1.综合微生物学、分子生物学、细胞生物学、药学、化学等多学科的知识，对一种南海软珊瑚的次级代谢产物进行研究，为进一步扩大天然生物中的活性成分筛选，开发出更多的高效低

19、毒的天然抗肿瘤药物，以便直接用于临床或作为先导物通过结构改造成新的抗癌成分。2.测定活性菌株的抗瘤谱，对抗瘤谱较好的菌株进行下一步研究。3.对抗肿瘤活性最强的一株菌株进行培养条件优化，更好地挖掘海洋微生物分离出抗肿瘤活性物质的潜力。研究内容内容太多，选取一部分即可。1.南海海域一种软珊瑚的共附生微生物的分离与活性筛选；2.采用MTT法，以胃癌、肝癌肿瘤细胞为筛选模型进行体外抗肿瘤活性的一级、二级筛选，并结合HPLC指纹图谱及薄层色谱进行化学筛选；3.选择（2）中抗肿瘤活性最高的一株菌株，命名为“ZZCL菌株”，结合分子生物学方法对该菌株进行系统的分类鉴定，并对其次生代谢产物进行系统研究；4.对

20、“ZZCL菌株”的发酵条件进行探讨，通过对不同浓度和种类的碳源、氮源、不同的发酵温度、培养时问、初始培养基pH等做正交实验来进行大量筛选，最终确定出最适的培养条件。拟采取的方案1. 样品处理用75%消毒酒精清洗样品表面无菌海水清洗样品表面3遍，制成共附微生物组织液用无菌组织匀浆器研磨至呈粘稠状液体切碎样品静置20min，上清液即为内生菌组织液1800r/min振荡1min3g于9ml无菌海水中2. 菌种分离各取适量体表和体内菌组织液配成浓度为10-1的母液，并依次稀释梯度至10-2、10-3,，各取0.2ml不同梯度的样品稀释液到相应的分离培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒在相应培养基表面轻轻地涂

21、布均匀，于28。C恒温培养箱培养，每天观察，待菌丝长出后，及时挑出形态差异较大的单菌落，采用平板划线法二次纯化后接种于固体斜面培养基，长成后置于冰箱4。C下保存。培养基配方：添加有两性霉素的LB培养基（分离细菌用），添加有硫酸链霉素的PDA培养基（分离真菌用），添加有0.03%重铬酸钾的高氏一号培养基（分离放线菌用） 。3. 菌种保存挑取纯化后的单菌落用20%甘油水溶液保存于保存管中，4。C保存备用。4. 抗肿瘤测试用MTT分析法进行抗肿瘤活性测试，即取对数生长期的小鼠肿瘤细胞，制成单细胞悬液，接细胞于96孔板中，培养过夜。加实验药物，再培养3d，PBS洗后加入MTT，再培养4h，去除MTT，

22、加DMSO与甘氨酸pH缓冲液，摇床摇0.51h（细胞看不见为止），酶标仪测定吸光度（A），=570nm。以阿霉素作为阳性对照。抑制率计算：抑制率=100%×（A对照-A实验）/ A实验发酵液活性以ID50衡量，ID50为抑制率为50%时发酵液所稀释的倍数；抗肿瘤药物的活性以IC50衡量，IC50为抑制率为50%时药物的浓度。5. 菌种鉴定形态学观察：在平板上点植“ZZCL菌株”，28。C培养3-10d，观察菌落形态、菌落颜色、产色素情况、表面渗出物情况。培养基均用海水配制，并添加抑菌剂。革兰氏染色：取“ZZCL菌株”的菌液，革兰氏染色，显微镜下观察。显微形态观察：在平板上点植“ZZC

23、L菌株”，28。C培养，观察菌丝形态、大小、表面特征、颜色、有无横隔、产孢器结构及孢子大小、形状、颜色。检索相关菌株鉴定手册，初步确定菌株的分类地位。18S rDNA序列分析及系统发育分析：技术路线如下“ZZCL菌株”菌丝体的收集 菌丝DNA的抽提 菌丝DNA PCR扩增 PCR产物回收 目的DNA片段的克隆 序列测定 GenBank Blast 分析 多序列比对 系统发育分析 6. 提取和分离将菌体和培养液分开收集，菌体风干后，用甲醇提取数次，提取液浓缩后，经硅胶柱层析，用石油醚乙酸乙酯，乙酸乙酯甲醇梯度洗脱，收集各组分再反复经过硅胶层析柱分离。“ZZCL菌株”的代谢产物提取分离流程图见图：

24、 ZZCL菌株 培养150L 抽滤 培养液菌体风干乙酸乙酯提取物 甲醇浸渍物 硅胶柱 溶剂 产物 梯度洗脱 硅胶柱 溶剂梯度洗脱 产物7. “ZZCL菌株”的发酵条件优化7.1 培养条件优化7.1.1 培养基的选择：在最佳碳源选择、最佳氮源选择、最佳无机盐选择、碳源浓度、氮源浓度、无机浓度这六个单因素实验基础上，选择L9（34）正交表安排实验。7.1.2 培养条件的选择：在培养基初始PH值、海水浓度、接种量、装液量、培养时间、温度这六个单因素实验基础上，同样选择L9（34）正交表安排实验。7.2 抗肿瘤活性物质理化性质初步研究采用优化后的培养基配方和培养条件对“ZZCL菌株”进行发酵，收集发酵

25、液5000r/min离心10min，取上清液进行性质确认实验：六份上清液分别置于室温、40、60、80、100和121水浴维持20min境中，维持7.2.1 稳定性实验抗肿瘤活性测试（以原始发酵液为对照）热稳定性 冷却至 室温取上清液回调pH值为原始pH值，并用蒸馏水调整每份发酵液为等体积取12份发酵上清液，用lmolL的HCI和lmolL的NaOH分别调pH值为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100和1200，4放置24h酸碱稳定性 离心抗肿瘤活性测试7.2.2 抗肿瘤活性物质萃取实验：取5份发酵上清液，分别加入等体积的三氯甲烷、石油醚、乙

26、酸乙酯、正丁醇和苯，振荡使二者混合，4"C放置24h，分别收集有机相和水相，测其抗肿瘤活性。本项目的特色和与创新之处建议精简。1.利用包括微生物学、分子生物学、细胞生物学、药学、化学等学科在内的多学科知识，使软珊瑚的研究乃至海洋天然产物的研究得到进一步的发展，使从海洋微生物中筛选抗肿瘤活性物质具有更广阔的前景。2.在传统的化学合成和人工培养 (包括细胞培养)的基础上,进一步优化和改进实验方法，以期能够解决海洋药物研究进程中的药源不足问题。3.开展海洋微生物的研究，将有利于促进我国海洋生物资源的开发利用。4.不只停留在药理作用可以和第二点结合，在传统的化学合成和人工培养 (包括细胞培养)的基础上,进一步优化和改进实验方法，探讨培养条件对抗肿瘤作用和生物活性物质的影响，为抗肿瘤新药的研究与开发提供母核结构和药物前体提供可能。可行性分析1. 研究表明软珊瑚大部分都含有丰富的化学物质，其分离出来的化学物质已经被证实能抑制癌细胞的增长，具有作为天然药物的潜力。2. 目前对于软珊瑚的相关分离