被子植物开花时间和花器官发育的表观遗传调控研究进展

1、园 艺 学 报 2014，41（6）：12451256 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131108；修回日期：20140410 基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（2571014EA03）；林木遗传育种国家重点实验室（东北林业大学）创新项目（C201016）；黑龙江省自然科学基金项目（C201016）；哈尔滨市科技创新人才专项资金项目（2013RFLXJ015） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：qijiangx

2、u；Tel 被子植物开花时间和花器官发育的表观遗传调控研究进展 李 巍，徐启江* （东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，生命科学学院，哈尔滨 150040） 摘 要：成花转换是被子植物生活周期中的关键发育过程，植物通过调控基因表达模式而整合多条内外开花信号实现成花诱导。近几十年来，学者们为阐释植物成花转换的分子机制做了大量的分子遗传学研究。其中，影响植物生长发育的表观遗传修饰是调控成花转换过程的重要分子机制之一。表观遗传调控是植物在适宜环境条件下实现开花诱导和花器官发育的决定性因素。综述了有关开花时间和花器官发育的表观遗传学研究进展，包括染色质重塑、组蛋白甲基

3、化和miRNAs。 关键词：被子植物；表观遗传；染色质重塑；miRNA；开花时间；花器官发育 中图分类号：S 68；Q 945.6 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1245-12 Epigenetic Research Progress on Flowering Time and Flower Organ Development in Angiosperms LI Wei and XU Qi-jiang* （The State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，College of Life Sciences

4、，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China） Abstract：The floral transition is a critical developmental process in angiosperms life cycle. Plants integrate multiple endogenous and environmental signals through gene expression pattern changes to result in flowering. Over the past few decades，e

5、xtensive molecular genetic studies have elucidated the molecular mechanisms governing the floral transition. One key molecular mechanism for this transition involves epigenetic modifications that affect a number of aspects of plant growth and development. Epigenetic control is determinative in plant

6、s for coordinating the switch to flowering under favorable internal and external conditions and achieving reproductive success. In this review，research progress on the epigenetic regulation associated with flowering time and floral organ development. These epigenetic modifications include chromatin

7、remodeling，histone methylation，and the miRNAs that mediate epigenetic modifications. Key words：angiosperms；epigenetic；chromatin remodeling；miRNAs；flowering time；floral organ development 1246 园 艺 学 报 41卷 被子植物，即有花植物，是植物界进化最高级、种类最多、分布最广的类群，约有35万种。植物开花过程是个复合的多步骤过程，适当的开花时间对植物的成功繁殖很重要。植物开花时间和花器官发育受到众多基因的复

8、杂调控，其中包括花器官特征基因、开花整合因子和一些进化保守的microRNAs（miRNAs）。随着分子生物学技术不断进步和发展，人们已经从众多模式植物如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、矮牵牛（Petunia hybrida）、金鱼草（Antirrhinum majus）等分离并鉴定了包括miRNAs在内的许多影响植物开花时间和花器官发育的基因与调控因子。表观遗传学（epigenetics）是指DNA序列未发生变化，但是基因表达却发生了可遗传的改变。不仅是基因组序列包含遗传信息，其修饰也可以记载遗传信息。表观遗传现

9、象包括DNA甲基化、RNA干扰、组蛋白修饰等。近年来在开花基因座C（FLOWERING LOCUS C，FLC）表观遗传调控过程中发现两个长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），即冷诱导的长链基因内反义RNA（cold induced long antisense intragenic RNA，COOLAIR）和冷辅助内含子非编码RNA（cold assisted intronic noncoding RNA，COLDAIR），二者通过寒冷诱导，促进春化过程的发生。这两个IncRNAs的研究为春化作用调控机制提供了新思路。目前发现非编码RNA在表观遗传学的调控

10、中也起到重要作用。同时，作为开花负调控因子，FLC是调控植物开花时间的关键基因，通过FLC染色质修饰而实现对其调控作用。表观遗传是被子植物开花信号通路中的重要机制，对开花及花器官发育产生关键调控作用，深入解析表观遗传调控开花的机理，将为通过表观遗传途径调控花发育奠定理论基础。本文中主要综述了染色体重塑、组蛋白甲基化和miRNA（包括miRNA172、miRNA156、miRNA159、miRNA169、miRNA319及miRNA167/160）对被子植物开花时间及花器官发育调控机制的研究进展。 1 染色体重塑对植物春化的影响 在真核生物中，染色质是由DNA和组蛋白一起被压缩成的一个高度有序的

11、结构。核小体是染色质的基本结构单位，其核心是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子所组成的组蛋白八聚体，每一个核小体中都有146 bp的DNA缠绕在组蛋白八聚体上，核小体之间由组蛋白H1和DNA结合。染色质重塑（chromatin remodeling）就是基因表达调控过程中出现的一系列染色质结构变化的总称。 春化作用（vernalization）为低温（一般4 ，14 15 d）诱导开花，它只是诱导植物开花的必要条件，而不是充分条件，经过春化处理的幼苗在常温下不会立即开花，需要数周以后才能开花，低温诱导和开花之间这种明显的时间间隔表明植物细胞有记忆功能经春化处理的植物回到常温后，FLC mR

12、NA水平仍然很低，这种低水平不会因有丝分裂而改变。 在春化之前FLC位点的染色质是有强转录活性的，在冷处理之前FLC的表达水平和激活型组蛋白修饰H3K4三甲基化水平很高。催化H3K4甲基化的甲基转移酶Set1/COMPASS（complex of proteins associated with Set1）复合体与启动子和转录早期的RNA聚合酶复合物结合，给FLC染色体打上“活性”标签，而且这个标签会被RNA聚合酶相关因子1（RNA-polymerase associated factor 1，PAF1）识别进行激活转录。在寒冷环境下，FLC染色质从“激活”到“抑制”状态发生明显转变，并伴随着

13、抑制型组蛋白的修饰H3K9和H3K27甲基化的增加。在这个过程中有3个重要因子VERNALIZATION INSENSITIVE 3（VIN3）、VERNALIZATION 1（VRN1）和VRN2起作用（Gendall et al.，2001；Levy et al.，2002；Sung & Amasino，2004），并推测VRN1、VRN2和VIN3对FLC基因表达调控是通过调节FLC 基因染色质中组蛋白不同化学修饰状态实现的。人们普遍认为植物同源结构域（plant homeodomain，PHD）参与蛋白质蛋白质相互作用，常见于染色质重塑复合体各个成员的分子结构中（Sung &a

14、mp; Amasino，2004）。VIN3编码的PHD结构域蛋白与染色质空间结构的6期 李 巍等：被子植物开花时间和花器官发育的表观遗传调控研究进展 1247 变化有关（Sung & Amasino，2004）。在vin3突变体中FLC含量没有下降，证明了VIN3在形成FLC染色质抑制状态起到了重要作用。VRN1和VRN2蛋白通过维持由VIN3引起的H3K9和H3K27甲基化来维持FLC的抑制状态。VRN2编码锌指结构蛋白，通过对组蛋白氨基端特异氨基酸脱乙酰化和甲基化修饰使染色质保持沉默状态。VRN1编码一种植物特有的DNA结合蛋白（Levy et al.，2002），改变染色质结构

15、。 春化过程中，FLC的表达活性逐渐减弱，植物同源域多梳蛋白抑制复合体2（plant homeodomain- polycomb repressive complex 2，PHD-PRC2）结合到FLC上。最近的研究表明，PRC2作为一种组蛋白甲基转移酶，主要促进H3K27三甲基化。除了PRC2的核心部分，PHD-PRC2还含有植物特异性组分，可以提高PRC2组蛋白甲基转移酶活性。同时在冷处理过程中，FLC位点的H3K27me3水平不断上升。虽然H3K27me3对于维持FLC沉默是必要的，但是还不够，在vernalization1（vrn1）突变体中，春化结束后FLC活性得到恢复，即使高甲基化

16、水平的H3K27仍然存在（Bastow et al.，2004）。H3K27me3不能直接引起染色体的压缩或者抑制转录，但是可以抑制起始FLC转录的蛋白因子对FLC启动子序列的识别。PRC2自身结合H3K27me3，可以对未修饰的新合成蛋白质进行甲基化处理，从而使这个标记在整个细胞分裂过程中稳定遗传。但是，PcG（polycomb group）蛋白复合体缺乏与DNA结合的能力，那么它们是如何结合到FLC这样的靶基因上的？大量试验证明，两个非编码的RNA参与了春化诱导的PHD-PRC2与FLC结合。调节FLC表观沉默的lncRNA COLDAIR，其转录本长1.1 kb，由FLC正义链第1个内含

17、子形成，具有5帽子结构，但是缺少3多聚腺苷酸（poly A）结构。研究显示PHD-PRC2复合体的催化亚基卷叶蛋白（CURLY LEAF，CLF）可以结合到COLDAIR RNA上（Heo & Sung，2011）。这个过程可以帮助PHD-PRC2与FLC结合。对COLDAIR进行RNA干涉会减少CLF与FLC的结合，最终损害冷处理后FLC沉默的维持。第2个非编码RNA即COOLAIR，也来自于FLC（Swiezewski et al.，2009），由RNA聚合酶（RNA polymerase，Pol）转录，是植物体内天然存在的FLC反向转录本，具有典型的5帽子结构和3 poly A结

18、构。像COLDAIR一样，COOLAIR的表达也会在冷处理后显著上调。在春化过程中，FLC编码区3端下游启动子启动COOLAIR表达。根据剪切方式的不同，COOLAIR分为近端和远端两种类型。COOLAIR转录本在近端和远端分别有两个多聚腺苷酸化位点。在COOLAIR远3端的聚腺苷酸化与FLC的高丰度表达相关。在近3端与FLC的低丰度表达相关。两个自主途径基因FCA和FPA编码RNA结合蛋白，促进了COOLAIR转录本近多聚腺苷酸化位点3端的形成，清除了激活型组蛋白修饰（FLC的H3K4me3）（Hornyik et al.，2010；Liu et al.，2010a），最终引起FLC转录水平

19、下调促进开花。 2 miRNA调控植物开花时间 2.1 miRNA的合成 miRNA是由内源基因编码、长度约21 23 nt的非编码小RNA分子，作为负调控因子主要在转录后水平上调节基因的活性（Hüttenhofer et al.，2002），通过与靶基因的互补位点结合而降解或抑制靶mRNA的翻译。植物存在大量的miRNAs家族，miRNA在调控植物发育方面发挥着广泛的作用。从成花诱导到花器官特征属性的形成，miRNA在整个花发育过程均发挥着关键作用（Llave et al.，2002；Park et al.，2002；Reinhart et al.，2002）。miRNA通常由独立

20、的转录单位编码，由核酸内切酶Dicer加工而成，Dicer酶特异性的对具有发夹结构的70 90 nt的双链RNA前体（pre-miRNA）进行剪切，产生miRNA/miRNA*二聚体，而后miRNA选择性的整合到AGO（argonaute）等蛋白质上而形成RNA诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC）。此时miRNA*从AGO复1248 园 艺 学 报 41卷 合物中脱离，RISC通过抑制靶基因的翻译或者对靶基因进行切割，从而调控基因的表达。在拟南芥中的10个AGO家族蛋白，其中AGO1是miRNA合成途径中最重要的因子。 2.2 miRNA172

21、调控拟南芥开花时间 拟南芥MIR172基因组包含5类：MIR172a、MIR172b、MIR172c、MIR172d和MIR172e。基于miR172对开花调控机理的研究，miR172已成为翻译抑制最好的例子（Chen，2004）。最近的研究显示miR172可以通过降解靶基因mRNA（Jung et al.，2007；Wollmann et al.，2011）来进行调控。在拟南芥中，miR172调控具有miR172结合位点的APETALA2（AP2）类转录因子基因，包括AP2、TARGET OF EAT1（TOE1）、TOE2、TOE3、SCHLAFMUTZE（SMZ）和SCHNARCHZAP

22、FEN（SNZ）。 Aukerman和Sakai（2003）首次发现miR172对于开花时间的调控作用。miR172b过表达突变体植株（eat-D）是早花突变体。与35S：miR172早花表型相比，miR172的靶基因TOE1过表达导致了晚花表型。这个观察证明了TOE1是控制开花时间的抑制因子。与此相同，toe1的缺失突变体导致开花稍微提前，这个表型在TOE2基因的缺失突变体中加强了。然而toe1 toe2双突变体开花时间仍然比miR172过表达突变体晚，意味着除了TOE1和TOE2还有其他因子抑制开花。最近的研究表明SMZ和SNZ过表达突变体开花比野生型晚，虽然smz snz双突变体的开花时

23、间没有受到显著影响（Mathieu et al.，2009），但是toe1 toe2 smz snz四突变体开花比toe1 toe2双突变体早很多。但是四突变体开花却比35S：miR172株系晚，证明除了AP2家族，仍然有其他基因起到抑制作用。 AP2家族基因通过编码转录抑制子来控制开花时间。AP2可以直接结合到开花途径的整合因子SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1（SOC1）和花分生组织决定基因APETALA1（AP1）启动子上（Yant et al.，2010）。染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation-sequenci

24、ng，ChIP-Seq）分析发现AP2蛋白也结合到TOE3启动子上（Yant et al.，2010），证明在AP2家族基因之间存在反馈调节环。另一个AP2家族蛋白SMZ直接结合到光周期途径开花时间调控因子FLOWERING LOCUS T （FT）下游1.5 kb处，并抑制其转录。在茎尖分生组织中，除了SOC1和FT，SMZ也直接结合到AP1上（Mathieu et al.，2009）。由于在toe1 toe2双突变体中FT的表达上调，所以FT被认为是TOE1和TOE2蛋白的靶基因（Jung et al.，2007）。 除了TOE3，AP2家族基因的转录水平随着种子萌发不断下降（Aukerm

25、an & Sakai，2003；Jung et al.，2007；Mathieu et al.，2009）。这种时空表达模式可能是由于miR172活性的增加。miR172随着植物生长其表达量不断增加，主要受到SBP（SQUAMOSA promoter binding protein）盒转录因子的转录调控，而且miR172自身也受到miR156的调控（Wu et al.，2009）。通过抑制AP2家族基因的活性，SBP转录因子调控MIR172b的转录促使植物开花。 Jung等（2007）研究表明日照长度也可以影响拟南芥中miR172的表达水平。在长日照（long day，LD）条件下，m

26、iR172的积累比短日照（short day，SD）条件下多。相比光周期途径constans（co）突变体中miR172水平在gigantea（gi）突变体中有所下降。虽然GI作用在CO上游，但是miR172积累量的减少不依赖于CO作用。这个事实表明CO可能通过独立于miR172的作用途径调控开花时间。 温度是另一个影响开花时间的重要环境因素，同时也影响miR172的表达水平。Lee等（2010）检测植物16 时miRNA水平，发现miR172是一个应答环境温度的miRNA。最近的报道显示，拟南芥的RNA结合蛋白FCA对环境温度产生应答并促进pre-miR172的加工过程从而大量合成miR17

27、2，合成的miR172进而作用于开花调节因子FT诱导开花（Jung et al.，2012b）。FCA-miR172 调节子为植物提供了一个在变动的环境温度条件下对开花时间进行微调的自适应策略。 6期 李 巍等：被子植物开花时间和花器官发育的表观遗传调控研究进展 1249 2.3 miR156对植物开花时间的调控 植物的生长发育分为两个阶段：营养生长时期和生殖生长时期。营养生长时期主要是叶片的产生，生殖生长时期主要是开花和结果。营养生长时期又包括幼年期和成年期。miR156是植物生长周期转变的主要调控基因，控制营养生长期到生殖生长期、幼年期到成年期的转变。在拟南芥和玉米中，miR156被证明是

28、最为保守的miRNA，主要调控植物幼年期的生长。 在拟南芥基因组中，有10个等位基因编码miR156，包括最新发现的MIR156i和MIR156j（Breakfield et al.，2012）。miR156直接抑制转录因子SQUAMOSAPROMOTER BINDING PROTEIN LIKE（SPL）家族成员的表达。Klein等（1996）首次在金鱼草中发现了这些植物中特有转录因子，随后证实这类蛋白均含有一个对结合DNA所必需的高度保守结构域（SBP-box）。几乎所有的植物都含有SBP-box，其中有些含有miR156靶作用位点，这表明植物界中miR156和SBP-box靶基因对营养器

29、的生长周期转变起着重要的调控作用。拟南芥中17个家族成员SPL1到SPL16（包括两个编码相同蛋白的基因SPL13A和SPL13B），其中11个基因含有miR156的靶作用位点。SPL3过表达突变体的早花表型是第一个证据，证明了SPL基因参与开花时间调控（Cardon et al.，1999）。随着植物的生长，SPL3表达水平在不断上升（Cardon et al.，1999）。此外，Schmid 等（2003）证明光诱导引起了SPL基因的上调。 miR156的表达量在胚胎和幼苗早期很高（Wu & Poethig，2006；Nodine & Bartel，2010），随着植物的生

30、长而表达量逐渐下降（Schmid et al.，2003；Wu & Poethig，2006；Wang et al.，2009；Wu et al.，2009）。到目前为止，在几个具有开花表型的突变体和转基因植株中均检测到miR156的表达（Wang et al.，2009）。然而在这些突变体中miR156的表达量都没有受到影响，而且赤霉素和生长素也没有影响miR156的表达（Wang et al.，2009）。这些研究结果表明，miR156的表达水平并不受影响植物开花时间的因子调控，miR156的表达水平主要依赖于植物的年龄。 长日照条件下，miR156的过量表达会引起幼年期的延长，延

31、迟成年期的起始，同时下调SPL基因家族的表达（Klein et al.，1996）。大多数miR156靶基因SPL的表达量随着植物的生长逐渐增加（Cardon et al.，1999；Schmid et al.，2003；Wu & Poethig，2006；Wang et al.，2009；Wu et al.，2009；Yamaguchi et al.，2009），当靶基因的表达量积累到一定丰度就会启动下游基因表达，从而诱导开花。这种表达模式反映了miR156对于植物的正常生长尤其是对开花时间很重要。当miR156的调控受到SPL基因上miR156靶位点突变的干扰，植物可以提早开花，同

32、时SPL大量表达（Wu & Poethig，2006；Wang et al.，2009）。SPL3的过表达可以促使植物提前开花，同时SPL3 mRNA在向开花转变的过程中上升（Cardon et al.，2002）。SPL3有两个同源基因SPL4和SPL5，SPL3过表达没有导致花序分生组织基因LEAFY（LFY），APETALA1（AP1）和FRUITFULL（FUL）表达的上调，但是SPL4或者SPL5过表达导致了这3个基因表达量的增加。说明虽然SPL3、SPL4、SPL5基因序列相似，均调控花分生组织形成基因，但是作用是不一致的（Yamaguchi et al.，2009）。SP

33、L9 的表达量远远低于SPL3，SPL9促进了成年期的形态特征形成。SPL10 也调控营养生长阶段的变化，但是其过表达的表现型与SPL9不同，因此可能与SPL9有不同的功能。 miR156/SPL模型以两种不同方式调控开花时间：一是通过miR172调控消除AP2家族基因产生的开花抑制；二是通过直接促进开花整合因子和分生组织形成调控因子。SPL9直接结合到MIR172b的调控区域并诱导MIR172b表达（Wu et al.，2009）。miR172抑制AP2家族转录因子的表达，使植物应答适当的刺激从而诱导开花。除了miR172，开花整合因子SOC1和它的同源基因AGAMOUS-LIKE 24（A

34、GL24）也是SPL9的直接靶基因（Wang et al.，2009）。虽然FUL调节开花时间的作用还不明确，但是FUL受到SPL9和SPL3的调控，也是SPL9和SPL3过表达突变体产生早1250 园 艺 学 报 41卷 花表型的原因（Wang et al.，2009；Yamaguchi et al.，2009）。最近也发现FT启动子与SPL3之间的联系，染色质免疫沉淀技术证明了SPL3蛋白可以直接结合到FT启动子的GTAC基序上（Kim et al.，2012）。 因为pri-miR156a的表达量随着植物的发育而逐渐下降（Wang et al.，2009），所以miR156积累水平的下降

35、是由于其转录水平下降引起的。如果把已经形成的叶片去掉，miR156的水平反而上升（Yang et al.，2011）。证明叶原基是调控miR156积累量的信号之源。此外，环境温度会影响miR156和miR172的积累量（Lee et al.，2010；Kim et al.，2012），证明环境因子通过影响这两个miRNAs的积累量进而调节植物生长。 SPL积累的时空模式对于理解年龄途径及植物生长与环境因子之间的复杂关系很重要。通过提高光周期途径因子CO或FT活性从而促进SPL基因的表达，与miR156对SPL的调控途径不同（Schmid et al.，2003；Wang et al.，2009

36、）。这种作用模式可能直接受到花开整合因子SOC1和FT的调控（Jung et al.，2012a）。在长日照条件下，FT和转录因子FD一起直接或通过SOC1调控SPL基因的表达，促进光周期途径诱导植物开花。在短日照条件下，SOC1通过结合到SPL基因启动子上，促进赤霉素途径诱导植物开花（Jung et al.，2012a）。作为对环境温度的应答，miR156-SPL3相互作用模块和FT基因共同调控温敏植物的开花时间（Kim et al.，2012）。因此，miR156对于开花植物的阶段转变、开花时机、花的形成起着重要的调节作用，同时也可以调控miR172等其他miRNA。 2.4 miRNA1

37、59对植物开花时间的调控 第3类小RNA miR159在赤霉素途径中起着重要作用。拟南芥中，由于在长日照条件下的Gibberellic Acid（GA）缺失突变体ga1没有表现出显著的开花表型，所以GA对于开花时间的影响一直被人们忽略了。但是在短日照条件下，ga1缺失突变体却需要GA来促进开花（Wilson et al.，1992）。GA受体GIBBERELLIC INSENSITIVE DWARF1（GID1）的发现，引起了研究者对GA影响开花时间的重视。在长日照条件下，3个GID1受体功能冗余拷贝的三突变体表现出晚花表型（Griffiths et al.，2006；Willige et a

38、l.，2007），证明GA是长日照条件下调控开花时间的重要线索。 花序分生组织基因LFY参与赤霉素途径。GA信号受到LFY启动子上GAMYB结合因子的调控，在短日照条件下GA提高了LFY启动子活性（Blazquez et al.，1998；Blazquez & Weigel，2000）。在拟南芥GAMYBs家族中，MYB33结合到LFY启动子的GAMYB结合域上，MYB33的表达可以导致GA外源性或内源性水平的增加，证明了GAMYBs对于GA调控的开花促进起到重要的作用（Gocal et al.，2001）。 在拟南芥中，MIR159a、MIR159b和MIR159c构成了miR159

39、家族。这些miRNAs主要作用于GAMYB类转录因子，包括MYB33、MYB65和MYB101。在植物分生组织中MYB33表达受到miR159强烈的抑制（Alonso-Peral et al.，2010）。短日照条件下，miR159过表达，植物开花延迟，而且MYB33和LFY水平降低（Achard et al.，2004）。这些观察至少证明有一部分miR159通过赤霉素途径调控开花时间。但是miR159表达量和GA之间的关系还不是很明确，需要进一步研究miR159与GA之间的调控模式。 3 miRNAs调控花器官的形成 3.1 miRNA159调控花药的生长 被子植物中对于花药的调控是保守的。

40、在拟南芥、水稻和大麦（Hordeum vulgare）中，MIR1596期 李 巍等：被子植物开花时间和花器官发育的表观遗传调控研究进展 1251 及其靶基因GAMYB-相关的基因对于花药的正常生长是必须的（Achard et al.，2004）。GAMYB首次在大麦糊粉细胞中作为种子发育阶段GA信号途径的正调节因子被发现（Gubler et al.，1999）。随后的研究揭示了GAMYB也作用在花发育阶段（Murray et al.，2003）。在大麦中，HvGAMYB的过表达导致花药长度的减少，并引起雄性不育（Murray et al.，2003）。GAMYB基因也在其它物种中被发现，例如

41、拟南芥、水稻、燕麦（Avena sativa）等（Woodger et al.，2003；Achard et al.，2004；Tsuji et al.，2006），其作用和表达是高度保守的，而且都有保守的miR159结合位点。 拟南芥MYB33和MYB65都属于GAMYB家族。AtMYB33的表达限制在小的花药中。拟南芥中myb33/myb65双突变体导致绒毡层肥大和花粉不育。miR159过表达减少了AtMYB33的表达量，引起花药败育，雄性不育并延迟了开花时间（Achard et al.，2004；Schwab et al.，2005）。Alonso-Peral 等（2010）发现miR1

42、59作为一个分子开关可以限制MYB33和MYB65在花药中表达。 在水稻中，OsGAMYB表达也具有花药特异性，并与miR159表达呈负相关（Tsuji et al.，2006；Aya et al.，2009）。OsGAMYB的缺失突变体引起花药和花粉的败育（Kaneko et al.，2004）。OsGAMYB也可以直接调控小孢子的发育（Aya et al.，2009）。最近的研究发现了miR159与GAMYB在草莓（Fragaria × ananassa）中的作用（Csukasi et al.，2012），两类草莓的miR159家族成员Fa-miR159a和Fa-miR159b与

43、Fa-GAMYB基因在果托的生长中相互作用，共同应答GA内源水平的变化。 3.2 miRNA319对花瓣生长的调控 miR319基因家族是由3个成员（miR319a、miR319b和miR319c）组成。Li等（2011）发现，拟南芥miR159与miR319有17个相同的核苷酸，而且这两个miRNA是由一个共同的祖先基因进化而来。然而，miR159和miR319有不同的表达模式并且作用于不同的基因，所以有不同的作用。miR159作用于几个调控开花和花药生长的GAMYB转录因子，但是miR319作用于调控叶片和花生长的TCP转录因子（Palatnik et al.，2007；Nag et al

44、.，2009）。在花序中过量表达和沉默miR319a基因，TCP （TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF）类转录因子的mRNA水平相对于野生型花序中的mRNA水平表现为下调表达和上调表达，表明miR319a可能通过结合并调节TCP类转录因子而在花发育过程中起作用。其中miR319a功能缺失突变体的花瓣宽度变小，花瓣和雄蕊长度减小（Koyama et al.，2007；Nag et al.，2009；Sarvepalli & Nath，2011）。 3.3 miRNA167和miRNA160通过调控ARFs而控制花器官形成 生长素应答因子ARF（AUXIN RE

45、SPONSE FACTORS）通过结合到植物激素应答元件的启动子上从而调控大量激素应答基因（Mockaitis & Estelle，2008）。一些ARF蛋白已经被证明调控花器官的形成，受到miRNAs的调控（Mallory et al.，2005；Wu & Poethig，2006；Wu et al.，2006；Chapman & Estelle，2009）。在已知的ARF基因中，ARF6和ARF8是miR167的靶基因，ARF10、ARF16和ARF17是miR160的靶基因（Mallory et al.，2005；Wu et al.，2006）。 ARF6和ARF

46、8对胚珠和花药的生长是必要的（Nagpal et al.，2005；Wu & Poethig，2006；Wu et al.，2006）。arf6 arf8双缺失突变体导致了花药和雌蕊的败育，如雄蕊变短，花药不开裂和胚珠珠被败育。miR167的过表达导致ARF6和ARF8转录本水平下降，出现与arf6/arf8双突变体相似的表型，花药不开裂，不能释放花粉。说明生长素应答因子ARF6和ARF8基因是miR167的直接靶点，miR167下调ARF6/ARF8对花粉发育很重要。水稻中，在花药生长的晚期miR167含量达到很高水平，证明miR167调控花药生长是保守的（Fujioka et al

47、.，2008）。miR167界定ARF6和ARF8在雄蕊和胚珠中的正确表达区域（Wu et al.，2006），确保萼片、花瓣、花药、雌蕊和胚珠的正常发育，包括其外在形状、内部细胞大小、花粉粒萌发率以及柱头、胚轴的长短等性状（Ru et al.，2006）。 1252 园 艺 学 报 41卷 试验证明miR160负调控ARF10、ARF16和ARF17（Mallory et al.，2005；Liu et al.，2010b）。一个Ds转座子插入在miR160的3调控区域的心皮缺失突变体（floral organs in carpels，foc）导致形成不规则形状的花，育性下降（Mallory

48、 et al.，2005；Liu et al.，2010b）。在foc突变体中，由于miR160表达水平下降，导致ARF1、ARF16和ARF17转录水平比野生型高。 3.4 miRNA169控制植物生殖器官的发育 被子植物花器官发育的ABCE模型指出，C功能基因在第3、4轮中表达，分别决定雄蕊和心皮的特征属性。C功能基因的表达活性受到miR169的抑制。Cartolano等（2007）的研究发现，金鱼草的FISTULATA（FIS）基因和矮牵牛的BLIND（BL）基因编码miR169。FIS和BL将C类基因的活性限制在内两轮花器官而调控雄蕊和心皮的发育。FIS和BL的缺失突变体导致在第2轮花

49、器官中出现雄蕊化的花瓣。miR169调控NF-YA转录因子基因家族（Jones-Rhoades & Bartel，2004）。由于NF-YA转录因子可以促进C类基因的表达，miR169被认为是通过对NF-YA转录后抑制从而抑制C类基因的活性。此外，Zhang 等（2011）发现miR169的过表达转基因番茄植株Sly-miR169c的气孔开张度减少，降低叶片水分流失，从而增强抗旱性。 miR169的靶基因是NF-YA类转录因子家族成员（此类转录因子与C功能基因PLE/pMADS3的CCAAT盒结合）（Cartolano et al.，2007）。在拟南芥中，尽管miR169也调控NFY

50、A5基因，却不能进一步抑制C功能基因的活性。由此推测，miR169主要在金鱼草和矮牵牛中通过抑制C功能基因活性维持花的正常发育。 4 结论与展望 植物发育表观遗传机制是表观遗传学的一个重要分支，近些年来发展迅速，成为当前植物学研究领域的一个热点，主要是指在DNA序列未发生改变的情况下，DNA甲基化、染色质结构状态、非编码RNA等因素的改变，使基因功能发生可遗传的变化，并最终导致表型变异的遗传现象。染色质的修饰作用对于获得稳定的基因表达，进而形成长期的分子记忆很关键。春化途径对植物开花时间的调节是通过改变开花抑制基因FLC的染色质结构来抑制其表达而促进开花，近期研究发现lncRNA COOLAI

51、R和COLDAIR在染色质重塑方面的作用，为进一步研究春化途径提供新的思路。同时，miRNAs也参与了对植物开花时间以及花器官发育的调控。 花发育是被子植物生命周期中一个重要的综合发育过程，涉及不同发育方式的转换，包括开花诱导、信号传递、属性决定、器官发生，既受环境因子（如光周期、温度等）的诱导，又受到自身内部因素的调节，经过一系列信号转导过程，启动成花决定过程中的控制基因。在复杂的基因互作网络调控下，营养茎端分生组织（vegetative meristem，VM）转变为花序分生组织（inflorescence meristem，IM），然后在IM的侧翼形成花分生组织（floral meris

52、tem，FM），分化出花器官。从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中鉴定出了180多个参与调控开花的基因，并确定存在6条调控开花的信号途径：即光周期途径（photoperiod pathway）、春化途径（vernalization pathway）、自主途径（autonomous pathway）、赤霉素途径（gibberellin pathway）、温敏途径（thermosensory pathway）和年龄途径（aging pathway）（Fornara et al.，2010）。表观遗传是开花信号通路中的重要机制，对开花及花器官发育产生关键调控作用。miRNAs的表观

53、遗传调控机制是植物分子发育生物研究的重要领域，例如miR172、miR156、miR159参与了开花诱导的信号转导途径，共同开启花的发育过程（图1）。 6期 李 巍等：被子植物开花时间和花器官发育的表观遗传调控研究进展 1253 图1 拟南芥miRNAs调控成花转换的分子机制 带箭头的直线表示激活作用，带垂直短线的直线表示抑制作用。 Fig. 1 The molecular mechanisms of miRNAs regulating floral transition in Arabidopsis Lines with arrowheads represent activation，and

54、 with perpendicular bars represent repression. 除了miR156、miR172和miR159，还有其他miRNAs在调控植物开花时间上起到重要作用。水稻的miR393靶基因编码生长素受体OsTIR1和OsAFB2（Xia et al.，2012）。miR393含量增加不仅显示出对生长素的低敏感性，也可以促进植物开花，证明生长素信号在开花时间的作用。miR399和它的靶基因PHOSPHATE2（PHO2）参与调控植物开花时间（Kim et al.，2011）。在拟南芥中，在常温23 和16 时，miR399过表达突变体和pho2突变体呈现早花表型，可

55、能是由于TWIN SISTER OF FT（TSF）的大量表达。近年来，组蛋白甲基化对于植物开花时间的调控作用受到更多的关注，Sui等（2013）发现H3K36甲基化修饰参与了对水稻开花时间的调控。Sun等（2013）通过转基因手段研究发现苹果Md-miRNA156h在生长阶段转变、开花时间、育性及种子萌发等方面的作用。 目前对植物miRNA等表观遗传学的研究主要局限于几种模式植物，例如拟南芥、矮牵牛、玉米、金鱼草等，应该不断拓宽植物花发育表观遗传学研究的领域，在园艺作物中进行更为深入的研究，了解染色质修饰特征和miRNA表达谱，鉴定与基因表达有关的转录因子、调控因子以及维持表观遗传状态的调控通路，获取DNA甲基化修饰、组蛋白修饰以及非编码RNA等信息，帮助研究者更好地理解表观遗传学在园艺植物花发育中的作用机制，并了解这些调控基因表达的表观遗传机制如何对细胞分化发挥调控作用，以期为通过分子生物学手段调控园艺植物花期奠定理论基础。 References Achard P，Herr A，Baulcombe D C，Harberd N P. 2004. Modulation of floral development by a gibberellin-regulated