qPCR操作步骤

1、QPCR （Real-time Quantitative PCR Detecting System）即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。标准的两步法：RNA提取一随机引物反转录 一反转录产物 10倍稀释 一 real-time PCR.注意：1高质量的RNAt取，这里的高质量不是强调 RNA窜解，而是强调RNA 的纯度，不能含有基因组 DNA以及其他杂质污染。基因组 DNA的存在会导致定 量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量 PCR勺RNM、须使用DNas故t理， 消除DNA亏染。而RNAH勺杂质的7?染会限制real-time PCR勺反应，导致扩增 失败，

2、给你假阴性的结果。RNA勺降解不是关键，一个是因为定量 PCR勺引物扩 增目的长度本身很短，150-250个bp,并不用于扩增目标基因的全长。 此外是因 为存在内参基因，所以RNAW解会通过内参基因的测定来平衡。 毕竟一旦发生降 解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。2减少加样误差，在使用SYBRGreen MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成 MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模 板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅 是吸取一微开的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你 的定量精确度。3

3、选择合适的内参基因，一般用于定量PCR勺内参基因有好几种，但却没有完全 通用的内参基因。具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等， 内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最 小，最稳定的一个。4合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。Q-PC唯验流程：一、实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套 /一次性薄膜手套，RNA 抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用银子，不可以用使用过的手套直接取用。 取完EP管/枪头后，袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中

4、不得带出超净台，移液器在 一天工作结束后调至最大量程，并用 75叱醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。 实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总RNAtt提1）细胞样品用1*PBS洗2次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （invitrogen） 溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNasefree EP管中使细胞充分裂 解，室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol溶液，混匀，室温放置5min 使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）；2）加入200/氯仿，剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触，室温 静置 3-5mi

5、n;3） 4 C下，14,000g离心15min,可见分为三层，RNA&上层水相，移至另 一个新的RNase free EP管;（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿 着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层 ）4）沉淀RNA加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振 荡器混匀），室温静置10min;5）4 C下，14,000g离心10min,收集RNAK淀（如离心后仍不见EP管底部有 沉淀,应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4c下，14,000g离心10min, 收集RNAM淀），去上清；6）用75%洗涤两次，1ml/次（12,000g离心5m

6、in）（加入乙醇后只需轻轻 颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干 或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量DEPO（至少15ul）溶解沉淀。三、去基因组使用RNase-free的DNase Promega）,按以下体系配置反应液，37c消化 30min, 65 c 灭活 10min。RNA301DNase ?20110 x buffer101H2O(RNase free)39.51RNasin0.51总体积1001然后按以下步骤操作：1）加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min,后14,000rpm, 离心15min,取上清

7、。2）加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm,离心15min, 取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20C静置15min;4）4 C下，14,000g离心15min,收集RN顺淀，去上清;5）用75叱醇洗涤两次（12,000g离心5min）,超净台风干；6）加入适量DEPO（至少15ul）溶解沉淀。四、总RNA屯度和完整性检测1）纯度检测：取1口RNA羊品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定 ODfi, OD260/OD280勺比值大于1.8,说明制备的RNA®纯，无蛋白质污染。2）总RNAI整性检测：取RNA羊品1，1%g脂糖凝胶电泳

8、80Vx 20min, EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照，总 RNA勺5s rRNA, 18s rRNA和 28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总 RNAt提比较完整。五、逆转录1. mRNA 1）在RNase free的PCRt中配置下列溶液.Total RNAHO1.0W g1总体积1212）将上述溶液吹打均匀，置85c保温5min,使RNAS性。随后立即冰上致 冷，以防止RNAM性；3）在该PCRt中加入下列试剂（Promega）oligo (dT)0.51i 1Random primer0.51i 110mM dNTP2.01i 1RNase inhibitor0

9、.51i 15 x buffer4.01i 1M-MLV0.51i 1总体积_8.01i 14）将上述20口 反应溶液30c保温10min;5） 42 C保温 50min;6） 85 C保温 10min;7）-20 C 保存。2. microRNA :使用茎环逆转录法，原理如下图:1）在去RNase的PCRt中配置以下溶液.total RNAX个miR逆转录引物HO1.00.5*XW g1i 1总体积12.51i 12)将上述溶液混匀，85c孵育5min,以打开RNAC级结构。随后立即置于 冰上，以防止RNAM性再次恢复二级结构；3)在另一去RNase的PCRt中配置以下溶液：10mM dNT

10、P (promega)2.01RNase inhibitor (promega)0.51U6逆转录引物0.515x buffer4.01M-MLV (promega)0.51总体积7.514)将3)溶液加入到1)溶液中，混匀后30c保温10min;5) 42 C孵育 50min;6) 85 c孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR佥测1 .引物测试：根据mRN股计的引物正式实验前需进行qPCRM试具特异性和扩增效率，具 体反应体系和反应条件如正式实验， 每对引物需做模板水对照。得到结果后，首 先根据熔解曲线判断引物特异性， 选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显 引物二聚体熔解曲线峰。若

11、设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好， 则应对 比各引物的扩增曲线，优先选择 Ct值小、扩增效率高 的引物进行正式实验。2 .确定上机内容后，先在记录本上编排好上机的样品排放顺序：(1) 一个样品的加样尽可能安排在同一行(2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板(3)正式实验：总体积15ul的体系配制：H2O 4ulSYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振荡均匀)上游引物0.5ul (10uM)下游引物0.5ul (10uM)一般多配0.5份-1份体系，总的体系配好后，在振荡器中振

12、荡均匀或用枪 吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。3 .CDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为 1:20稀释，如遇到基因表达低 的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNAK一定顺序排好后，即可加 至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上 标记好1-12的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中 间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲 线峰漂移。）4 .把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。5 .上机：5.1 先开电脑，进入 Windows界面。接着打开PCRZ电源开关。5.2 打开7500软件，选择“新建”，在“ Template”下拉菜单中选择“60” 或“65”（普通基因检测为“ 60”，MicroRNA检测为“65” ）5.3 打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的 孔位，剔除无反应管的孔位。5.4 点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机 时间-客户名字简写，如100830-1008-WL表示8月30日10点08分