MGB探针设计原则

1、总体原则? 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。? 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段一一这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要 相应提高退火温度。? 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容 易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。? 保持GC含量在20%和80%之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。? 为了保证效率和重复性，应避免重复的核甘酸序列，尤其是 G （不能

2、有4个连续的G）? 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。引物设计原则? 序列选取应在基因的保守区段? 避免引物自身或与引物之间形成 4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构? 典型的引物18到24个核昔长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核昔的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。? Tm值在55-65 C （因为60c核酸外切酶活性最高）,GC含量在40%-60%? 引物之间的TM相差避免超过2 c? 引物的3端避免使用碱基

3、A,引物的3端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基? 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。? Taqman探针技术要求片段长度在 50bp150bp? 引物末端（最后5个核昔酸）不能有超过 2个的G和C。探针设计原则? 探针位置尽可能地靠近上游引物? 探针长度应在15-45bp （最好是20-30bp）,以保证结合特异性? 检测探针的DNA折叠和二级结构? Tm值在65-70 C ,通常比引物 TM 值高5-10 C （至少要 5） , GC含量在40%- 70%? 探针的5端应避免使用G鸟嗯吟一一因为5G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬 灭作用。? 整条探针中，碱基

4、C的含量要明显高于 G的含量一一G含量高会降低反应效率，这时就应选择配 对的另一条链作为探针。? 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在 blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区， 建议重新设计引物探针。Taqman MGB 探针设计? 探针的5端避免出现G,即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。? Tm 值应为 65-67 C。? 尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于 13bp。? 尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现 4个或4个以上的G重复出现。? 原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到（MGB探针将

5、不会与目的片段杂交， 不产生荧光信号）。因此，在进行 SNP检测时，为了检测到突变子，即 Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。注意：为了满足上述要求的 4个条件，探针的突变位点可向3端移动，但突变位点至少在离3端2个碱基的前方（即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守），以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的5端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计

6、简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）一一而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。第四、五、六步：一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少,只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是：?扩增酶最好选用热启动酶?引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从50nM开始，在50nM900nM之间优化，一般为200nM （注意探针需要避光保存。? 同样Mg+和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U （50ul）? DNA模板的添加量通常在 100 ng以下，因不同种类的 DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同， 必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如果欲进行2