酶工程复习资料

1、一、名词解释：5T*21 Kcat：酶转换数。又称分子活性或摩尔催化活性，表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心或每个分子酶所能转化的底物分子数，单位为min-，是酶催化效率的一个指标。2溶解氧：溶解在培养基中的氧气，提供给在培养基中的产酶细胞使用。3临界氧浓度：微生物对发酵液中溶解氧浓度的不影响其正常代谢的最低要求。4氧载体：与水不互溶，对微生物无害，具有较高溶氧能力的有机物。5通气量：单位时间内流经培养液的气体量6溶氧速率/传氧率：表示在单位时间内培养液溶氧浓度的改变 耗氧速率：单位时间内细胞进行呼吸作用消耗的氧量7酶的化学修饰：在较温和的条件下，以可控制的方式使酶同某些化学试剂发生特异反

2、应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。8模拟酶/人工酶：根据酶作用的原理，模拟酶的活性中心及催化机理，用有机化学及生物学方法合成的具有专一催化功能的催化剂。9肽酶：模拟天然酶的活性部位，人工合成的具有催化活性的多肽。10抗体酶：具有催化功能的抗体分子。11印记酶：利用分子印记技术（MIP，即制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程）制备的人工模拟酶。12融合酶：将两个或多个酶分子组合在一起所形成的融合蛋白。13 SDM：定点突变技术。指在基因的特定位点引入突变，即通过取代、插入或删除已知DNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶蛋白结构中某个或某些特定的氨基酸，以此来提高酶对底物

3、的亲和力，增强酶的专一性等。14酶分子的定向进化：属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。15固定化酶：用物理或化学手段定位在限定的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利用的酶16固定化酶的活力：是固定化酶催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。 固定化酶的比活：每克干固定化酶所具有的酶活力单位数。 固定化效率：又称为酶结合效率，是指酶与载体结合的百分率。 活力回收率：固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。 相对酶活力：具

4、有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。 固定化酶的操作半衰期：在连续测定条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间。17 aw：水活度。在一定的温度与压力下，反应体系中水的蒸汽压与同样状态下纯水蒸汽压的比值，是确定酶结合水的多少的参数。18 PH记忆：有机溶剂中的酶能够保持其冷冻干燥前或沉淀前所在缓冲液中的pH。19 lgP：极性/疏水参数。某有机溶剂在正辛醇/水体系中分配系数P的对数，用来定量描述溶剂的极性。20酶对底物的相对专一性：某些酶可作用于一类化合物或一种化学键。对应体选择性/立体异构选择性：酶在催化一个可能产生多种异构体的反应时，优先得到其中一种异构体。

5、区域选择性：在酶促反应中，底物某一位置上的基团被酶选择性地转化，而另一位置上的相同基团没有被转化。前手性选择性：酶催化非手性底物选择性地形成具有一定立体构型的产物。21生物反应器：有效利用生物反应机能的系统。22生物传感器：以固定化的生物材料作为敏感元件，与适当的转换元件结合所构成的一类传感器。23（具体的定义后面简答题里有）搅拌罐式反应器（STR、分批：BSTR、连续：CSTR）；固定床式反应器（PBR）；流化床式反应器（FBR）；鼓泡式反应器（BCR）；膜式反应器（MR）二、选择15T*1酶学基础（第一章第2节和第3节）三、判断与改错10T*21做题方法 5个对，5个错一般写“确定、一定”

6、的不对若不会改，可用以下方法：“一定”改成“不一定”；“A是B”改成“A不是B”2有机介质中酶促反应（P182P194）3在使用共价结合法对酶进行固定化时，首先需要将载体的功能基团进行活化。活化的主要方法有：含羟基载体溴化氰法、乙基氯甲酸酯法、3-氨基丙基三乙基氧硅烷法；含羧基载体碳二亚胺法；含氨基载体重氮法、戊二醛活化法；含酰肼基团载体叠氮法4在酶的化学修饰中，常用的化学修饰剂：氨基化学修饰剂：二硝基氟苯（DNFB、Sanger试剂）、三硝基苯磺酸（TNBS）；羧基：（水溶性的）碳二亚胺、甲醇-HCI5底物浓度越大越好（X）底物浓度不是越大越好四、简答题：5T*5一、简述酶工程的概念及其研究

7、内容1酶工程就是将酶、细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。2研究内容包括：酶的制备（微生物细胞发酵产酶、动植物细胞培养产酶）酶的提取与分离纯化酶分子的改造（化学酶工程、生物酶工程）酶、细胞的固定化酶的非水相催化酶反应器和酶传感器酶抑制剂酶的应用二、在酶的发酵生产中，提高酶产量的措施 1添加诱导物：对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶量显著增加。诱导物一般可分为三类：酶的作用底物酶的反应产物酶的底物类似物2降低阻遏物浓度：微生物酶的生产受到代谢末端产物阻遏及分解代谢物阻遏的调节。

8、为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养液中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度3添加表面活性剂：非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，可能是由于它的作用改变了细胞的通透性，使更多的酶通过细胞膜泄露出来，从而打破了胞内酶合成的反馈调节，提高了酶的产量。此外，有些表面活性剂对酶分子有一定稳定作用，可以提高酶活力4添加产酶促进剂：产酶促进剂是指那些非微生物生长所必须，能提高酶产量但作用机理尚未阐明的物质，它可能是酶的激活剂或稳定剂，也可能是产酶微生物的生长因子，或有害金属螯合剂，也可以诱导酶的合成或者增强酶的稳定性。5菌种选育：通过诱变育种，基因工程

9、育种，选育出高产的菌种提高产酶三、结合酶的生物合成模式，谈如何提高酶的合成量1最理想的合成模式是延续合成。因为细胞开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入稳定期的后，酶还可以继续生成一段较长的时间。2对于同步合成型，尽量提高酶所对应的mRNA稳定性，可考虑从基因水平改造mRNA稳定性，此外也可考虑适当降低产酶期发酵温度。3对于中期合成型，则要从提高酶产对应的mRNA稳定性以及解除阻遏两方面进行。对于酶所对应的mRNA的稳定性，可从基因水平和发酵温度着手；通过改变基因的启动子，可解除酶生物合成的阻遏现象，也可以通过降低发酵过程培养液中阻遏物浓度的措施，解除阻遏。4对于滞后合成型，可考虑基因水平改造及

10、发酵过程控制两个方案解除阻遏，将产酶模式改变为延续合成型四、黑曲酶的合成模式问题以纯果胶为诱导物时为延续合成型。以纯果胶为诱导物时，黑曲酶的合成伴随着细胞的生长开始，但在细胞生长进入稳定期后，黑曲霉还可以延续合成较长的一段时间。以含葡萄糖的粗果胶为诱导物时为滞后合成型。以含葡萄糖的粗果胶为诱导物时，只有当葡萄糖被消耗完，黑曲酶才开始合成，也就是说细胞生长进入稳定期后，酶才开始合成并大量积累。五、酶的固定化方法的原理、优缺点（一般不会在一道题中问这么多）1吸附法通过氢键，疏水作用，离子键等物理作用，将酶固定于水不溶载体表面物理吸附法。优点：酶分子构象很少改变；缺点：结合力弱，易解吸附。离子交换吸

11、附法。优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏；缺点：结合力弱，容易受缓冲液种类和pH的影响，易解吸附。2包埋法将酶分子截留在具有特定网状结构载体中 优点：不需要与酶的氨基酸残基结合反应，很少改变酶的高级结构；酶活回收率高。缺点：过程中发生化学聚合反应，酶容易失活；另外只适用于小分子底物和产物的酶。3共价结合法 使酶分子同载体以共价键作用结合 优点：酶与载体结合牢固。缺点：条件苛刻，操作复杂；而且由于反应条件激烈，容易破坏部分活性中心。4交联法 利用双功能或多功能试剂在酶分子间，酶分子和惰性蛋白间，酶分子与载体间进行交联反应，形成网格结构的酶固定化。 优点：结

12、合牢固，可长期使用。缺点：固定化酶颗粒小，机械性能差，酶活性低。5无载体固定化法在无外来惰性载体的情况下固定酶。 优点：无载体固定化酶不溶于水也不溶于有机溶剂，回收方便；本身为高浓度酶的聚合物，有较高的催化剂比面积，一般具有比较高的催化活性，稳定性，耐高温，耐有机溶剂，耐外源蛋白酶水解；具有较大孔径结构，使溶剂、底物和产物的扩散阻力甚至可以忽略。 缺点：有些固定化酶机械稳定性差，酶活回收率低，对酶的存在形态有严格要求。六、固定化对酶的影响1固定化酶的活力要低于等摩尔游离酶的活力2固定化酶的热稳定性、pH稳定性、对变性剂的耐受性、酶制剂的贮存稳定性、操作稳定性有所提高3酶的最适温度是酶热稳定性与

13、酶反应温度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高。4用带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH较游离酶高；用带正电荷载体制备的酶，较低。5对于既可以作用于大分子底物又可以作用于小分子底物的酶，固定化之后其底物特异性往往会改变。6固定化之后酶分子的Km值发生变化，受酶分子空间构象、载体类型、固定化方法等因素综合制约。七、酶的化学修饰方法1肽链有限水解修饰2酶蛋白侧链基团修饰3大分子结合修饰4酶分子内与分子间交联5金属离子置换修饰6氨基酸置换修饰八、化学酶工程&生物酶工程研究内容1化学酶工程酶的分离工程（预处理酶的提取酶的分离纯化酶的浓缩干燥结晶）酶的固定化酶分子

14、化学修饰模拟酶（包括抗体酶、印记酶等）2生物酶工程酶基因的克隆与表达通过酶的定点突变以及定向进化进行酶分子的改造融合酶的制备与应用九、非水介质酶催化反应的特点/优点1在非水系统内，绝大多数有机化合物溶解度高，尤其是能提高非极性底物溶解度，而酶不溶于有机介质，因此酶易于回收再利用。2非水介质的参与可改变反应平衡，使酶可以催化在水中不能进行的反应。3能抑制依赖于水的某些不利反应和副产物。4从有机溶剂中分离纯化产物比从水中容易，从低沸点的溶剂中可以更容易地分离纯化产物。5酶在非水体系中热稳定性和储存稳定性增加，而且可以有效减少反应过程中的微生物污染6可以控制底物的特异性，区域选择性和立体选择性十、酶

15、在有机介质中活性下降的原因和解决方法原因:1.扩散限制2.封闭活性中心3.构象改变4.底物脱离溶剂束缚能力差5.过渡态不稳定化6.构象柔性降低7.亚最适pH值对应解决方法：1.增加搅拌速度，降低酶的颗粒大小2.用结晶酶代替3.使用冻干保护剂，制备有机溶剂中可溶解的并可与两亲性物质络合的酶4.选择溶剂5.选择溶剂以获得与过渡态有利的相互作用6。使水活度最适化，使用疏水溶剂7.pH记忆，使用有机缓冲液。十一、如何获得恒定的水活度/如何控制有机介质反应体系中的含水量1反应前，在有机介质反应体系中添加适量的水。适用于反应中没有水产生的催化反应2将酶、底物和溶剂分别在饱和盐溶液所形成的气相环境中进行预平

16、衡，使体系达到适当的含水量。也仅适用于没有水生成的催化反应。3对于反应过程中有水的消耗和产生的反应，通过向反应体系中通入一定含水量的惰性气体或空气的方法调节体系的含水量。4通过添加干燥剂控制水分的含量。适用于有水产生的催化反应。5使用渗透蒸发法，即通过均一的非多孔膜来实现体系中水的调控。十二、什么是生物反应器？理想的生物反应器应该具备哪些条件定义：有效利用生物反应机能的系统条件：1.所用生物催化剂应具有较高的比活及酶浓度（或细胞浓度）才能得到较大产品转化率2.能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳反应条件3.应具备良好的传质和混合性能4.应具有最佳的无菌条件十三、各类酶反应器的定义、优缺点。1搅

17、拌罐式反应器（STR）由反应罐、搅拌器和保温装置等组成的用于酶的催化的反应器。优点：设备简单，操作方便；反应条件容易调节控制；酶与底物混合较均匀；传质阻力较小；能处理胶态底物及不溶性底物。 缺点：一般通过使酶失活终止反应，游离酶不能回收重复利用；在搅拌反应过程中以及离心或者过滤中，固定化酶易破碎。2固定床式/填充床式反应器（PBR）将颗粒状或片状的固定化酶填充在柱形的固定床中所构成的固定化酶反应器。优点：单位体积所含酶量较多，催化效率高；产物从反应器中不断流出，减少了产物的抑制作用。 缺点：只适用于可溶性底物；难以控制条件；底物和产物会产生轴向浓度分布；更换固定化酶较麻烦；底层固定化酶受压力较

18、大，容易变形破碎。3流化床式反应器（FBR）底物溶液以一定流速从反应器底部连续通入，颗粒状固定化酶依靠流体作用保持悬浮翻动状态下进行催化反应的反应器。优点：混合均匀，传质和传热效果好；反应条件容易控制；不易堵塞，对黏度较大的反应液也可进行催化反应。 缺点：固定化酶始终处于悬浮翻动状态，易导致结构破坏；动力成本高；参数复杂，难以放大。 4鼓泡式反应器（BCR） 底物溶液和气体从反应器底部进入，气体产生气泡，从而使酶和反应液在保持混合均匀的状态下进行反应的反应器。优点：设备简单，操作方便；混合均匀，传质和传热效果好；剪切力小；适合于有气体参与的反应。5膜式反应器（MR）将酶的催化反应同膜的分离作用

19、相结合的酶反应器。优点：可以回收游离酶；小分子不断排除，减少产物抑制作用；底物转化率高；压降小；设备放大比较容易。缺点：使用时间长时，酶和其他杂质吸附于膜上，造成酶的损失，影响膜的分离性能；单位体积内催化有效面积小，制造成本高。6喷射式反应器利用高压蒸气喷射作用，实现酶与底物混合，进行高温短时催化反应的反应器。优点：结构简单；混合效果好；催化反应速度快，效率高。缺点：只能用于耐高温酶的催化反应，酶一般不能回收利用。十四、如何选择酶反应器 1根据酶的应用形式选择： 游离酶：搅拌罐式反应器、膜式反应器（可回收酶）、鼓泡式反应器（有气体参与）、喷射式反应器（耐高温酶） 固定酶：固定床式反应器（酶具有

20、一定机械强度，颗粒不宜太小）、流化床式反应器（酶颗粒不宜太大）、膜式反应器（酶颗粒不宜太大）、鼓泡式反应器（平板状、直管状、螺旋状的酶）2根据酶的反应动力学性质选择：从酶与底物的混合程度考虑；从底物浓度对酶反应速率的影响考虑；对于反应产物对酶具有反馈抑制作用的，使用膜式反应器（游离酶）、固定床式反应器（固定酶）；需要在高温下进行反应的酶，使用喷射式反应器。3根据底物或产物的理化性质选择：比如分子质量大小、溶解性、黏度、挥发性十五、生物传感器的分类1根据输出信号的产生方式分类：生物亲和型生物传感器（被测物与分子识别元件上敏感物质具有生物亲和作用，即二者能够特异性结合，同时引起敏感物质的分子结构或

21、固定介质发生物理变化）和代谢型生物传感器（被测物与分子识别元件上的敏感物质相互作用并生成产物，信号转换器将被测物的消耗或者产物的增加转变为输出信号）2根据分子识别元件上的敏感物质分类：酶传感器、细胞器传感器、微生物传感器、组织传感器、免疫传感器、基因传感器3根据信号传感器分类：电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测声型生物传感器十六、举例说明生物传感器的结构和原理 结构：由两个主要部分组成。一个是生物分子识别元件（感受器），是具有分子识别能力的生物活性物质，如酶、核酸、抗体、细胞等；另一个是信号转换器（换能器），主要有电化学电极（如电流、电位测量）、光学检测元件、热敏电阻、离

22、子敏场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等。 原理：将被测物与分子识别元件特异结合后所产生的各种信息转换成不同的信号输出，从而对被测物进行分析检测的过程。根据信号的不同，有几种分类：1将化学变化转化为电信号；2将热变化转化为电信号；3将光效应转换为电信号；4直接产生电信号。五、论述题2T*10（10点）一、酶的定向进化方法有哪些 1易错PCR：用PCR扩增目的基因时，通过使用低保真度的TaqDNA聚合酶或改变PCR常规的反应条件，如调整反应体系中四中dNTP的浓度、增加Mg2+的浓度、添加Mn2+等，引起碱基以某一频率进行随机错配而引入多点突变，构建突变裤，然后选择或筛选出所需的突变

23、体。 2DNA重组：用DNase1或者用超声波进行切割产生随机大小片段，再从正突变基因库中分离出所需DNA片段，得到的随机片段在不加引物的多次PCR循环中，彼此之间互为模板和引物进行扩增，直到连接成为接近目的基因长度的DNA分子，然后再利用基因两端序列为引物扩增获得全长基因，这是来自不同基因的片段之间的重组。3外显子改组：与DNA改组相似，都是在各自含突变的片段间进行交换。与DNA改组不同的是DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上，而外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，更适合于真核生物，可用于获得各种大小的随机肽库。 4随机引物体外重组法：以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，产生大量和模板不同位点互补的短片段，即DNA随机片段库。由于碱基的错配和错误引发，这些短的DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们之间可以相互同源引导和重组，类似于DNA重组组装成完整的基因长度，重新