人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程膀胱的研究.

1、人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织 工程膀胱的研究作者：王振显 蔡文清 庞国勋 宋永周陈康宁孙福振杨涛【摘要】目的 探讨人脱细胞羊膜（Human acellular amnioticmembrane，HAAM 负载大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs 进行膀胱替代修复的可能 性。方法用去污剂洗涤和酶消化方法制备 HAAM 将大鼠 MSC 在体外培养、扩 增、传代。取第 4 代干细胞用 19 二甲亚砜（DMS）预诱导 8 h，然后应用膀胱 匀浆上清液诱导 7 d。将诱导分化后的 MSC 接种于 HAAMfe 面进行短暂体外培 养，获得组织工程膀胱。将雄性大鼠 60 只随机分为 3 组，行半膀

2、胱切除术，然 后分别采用负载干细胞后的 HAA（ A组）、HAA（ B 组）以及单纯缝合（C 组） 的方法进行修补，每组 20 只。分别于术后2、4、8 w 测定膀胱容量、进行膀胱 造影并取材观察组织再生情况。结果去污剂洗涤联合酶消化法能有效去除人羊 膜中的细胞成分，光镜及电镜观察无细胞成分残留，细胞相容性好。大鼠膀胱 重建术后，A、B 两组与 C 组膀胱最大容量（Volmax）比较有极显著性差异（Pv0.01 ），而 A、B 两组之间膀胱最大容量比较无显著性差异（P0.05 ）。组织 学观察，2 w 时 HAAM 卩已吸收降解，膀胱移行细胞和平滑肌细胞开始形成，A组吻合修补区较厚，平滑肌细胞

3、规则且丰富。结论HAAM 作为膀胱移植物进行膀胱修补吸收降解迅速，负载 MSCSf 构建的组织工程膀胱是理想的替代修补材 料。【关键词】膀胱；移植；脱细胞羊膜；生物医学工程最早应用组织工程学原理进行组织工程膀胱构建的是Wake forest 大学医学院再生医学研究所的 Atala 等人，他们于 1998 年进行了同种异体狗再造膀胱的实 验研究1。目前组织工程学技术的研究主要集中在二个方面：支架材料的 研究与开发；种子细胞的培养和植入受损的组织，使其功能得到恢复。膀胱 无细胞基质和小肠黏膜下层是目前报道最多的组织工程膀胱支架材料。羊膜是 一种天然高分子生物材料，来源广泛， 不违背伦理。 本研究采

4、用化学去污剂和 酶消化的方法去除新鲜羊膜中的细胞成分，保留细胞外基质，制备人脱细胞羊 膜（HAAM 作为支架材料，并以大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）为种子细胞构建了组织工程膀胱，探讨异种来源的 HAAM 作为生物支架材料构建组织工程膀胱的 可行性。1材料与方法1.1实验材料46 周龄 100150 g 健康清洁级 SD 大鼠 2 只，8 周龄 220250 g 大鼠 4 只，雌雄不限。8 周龄以上成年健壮雄性 300500 g 大鼠 60 只，由河北医科 大学实验动物中心提供。LDME 及 0.25%胰蛋白酶（Sigma 公司），胎牛血清 （北京元亨圣马公司） 、，PBS 液， 二甲基亚砜

5、（DMSO 美国 R&D 公司） ， 1% TritonX100,小鼠抗大鼠a平滑肌肌动蛋白一抗，山羊抗小鼠二抗。日本Olympus 荧光倒置显微镜 IX71 和光学显微镜 CX31 SHZ 88 台式水浴恒温震 荡器（江苏太仓市实验设备厂）。1.2种子细胞培养1.2.1SD 大鼠 MSC 的分离与原代培养246 周龄大鼠 2 只，无菌取其双侧股骨、胫骨和胸骨，用 L DME 培养 基冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液，离心后用生长培养基重悬。将 细胞接种于培养瓶中，37C、5% C02 环境下常规培养。1.2.2大鼠膀胱匀浆上清液对 MSC 啲诱导分化8 周龄大鼠 4 只，无菌取其膀胱，

6、立即用 PBS 液冲洗，匀浆、离心，取上 清液用0.2 卩 m 的针头滤器过滤。取第 4 代 MSCs 以 2X104/ml 密度接种于预置 盖玻片的 6孔培养板中培养 2 d，使细胞贴壁。吸出培养基，换入含有 1% DMSO 的培养基预诱导8 h，然后换入膀胱匀浆上清液与 DME 为 1：1的混合培养基 培养 7 d。期间换液 1 次。1.2.3培养细胞免疫细胞化学染色鉴定及纯度计算诱导分化的 MSCs 以a平滑肌肌动蛋白（SMaactin ）抗体行免疫细胞染色，以未进行诱导的 MSCs 为阴性对照，进行同样的染色处理。光学显微 镜下观察，随机选择 10 个镜野，计算纯度，纯度二染色细胞数/

7、细胞总数，取平 均值。1.3HAAM 制备1.3.1羊膜的选材严格遵循供体医学标准。在获取健康胎盘后，PBS 液反复冲洗，钝性分离羊膜与绒毛膜组织，去除羊膜基底面残存的绒毛膜和血管组织，浸泡于以0.01mol/L PBS 液稀释的 1% TritonX 100 中，反复震荡摇晃 24 h，然后置入 1% 胰蛋白酶中再震荡摇晃 4 h 取出，PBS 冲洗。制备好的单层羊膜为白色半透明 的薄膜，有一定弹性及韧性，厚约 0.1 mm。由于其较薄，缺乏一定的张力，尚 不能用于手术修补。将 68 片处理好的单层羊膜按彼此纤维方向垂直的位置重 叠，以 200 W 的可见光照射 3 h，从而使其交联成 0.

8、60.8 mm 的较厚补片， 张力大大增加，能耐受缝合牵拉的力量。以钻60 射线照射 20 min 消毒（20kGy）后备用。1.3.2HAAM胞毒性测定按照文献3要求制备 HAANS#提液；取诱导分化的 MSCi 按 1X104 细胞/ 孔接种于 96 孔板，正常培养基组为对照组，浸提液组为实验组；MTT 法测定吸光度 A 值，计算细胞相对增殖率（RGR ,RGR=实验组 A 值/对照组 A 值，并对 材料毒性评分4。1.4组织工程膀胱的构建1.4.1MSCs 接种诱导分化后的 MSCs 以 2X104/ml密度接种于预置 2 cmX2 cm HAAM 的 6孔 培养板中后加培养基 2 ml

9、。置 37C、5%CO 培养箱内，在饱和湿度条件下复合 培养。1.4.2MSCs/HAA 复合物显微镜检查收获培养 36 h 的 MSCs/HAA 复合物，HE 染色光镜及扫描电镜检查。1.5大鼠膀胱修复重建实验1.5.1大鼠膀胱重建将 60 只兔随机分为 3 组，每组 20 只。麻醉后取下腹部正中切口，显露膀胱，游离膀胱周围组织，行半膀胱切除术，以婴幼儿输液器作为导尿管顺行置入，尿道外口处 4 号丝线妥善缝合固定尿管。A 组以 MSCs/HAA 复合物补片用 可吸收线缝合于膀胱缺损处，B 组以单纯 HAAh 补片修补膀胱，C 组不使用任何材料直接缝合。经尿管注水检查无漏尿。 A、B 两组以

10、丝线在吻合口 前、后、左、右（浆膜面，避免穿透）各缝 1 针作为标记。C 组吻合口上下端 以 丝线缝合 2针作为标记。尿管于术后 7d 拔出。所有动物术后均肌肉注射青霉素抗感染 3 d。1.5.2术后膀胱检测分别于术后 2、4、8 w 时，每组取 5 只动物处死。处死前测定膀胱最大容 积（Volmax）。方法是将膀胱排空，用注射器经细尿管（婴幼儿输液器）向膀胱 注入生理盐水，尿道外口有尿液滴出时注入的水量即为Volmax。解剖观察膀胱大体形态，并根据标记线取材固定，HE 染色后光镜下观察组织学变化。第 8 周 时各组动物进行膀胱造影后再进行前述处理。1.6统计学方法数据采用 xs表示,组间比较

11、采用 t 检验。2结果2.1种子细胞培养原代培养的骨髓细胞成分复杂，形状不规则。79d 细胞长满瓶底，主要 呈纺锤形细胞。诱导分化 7 d 后 MSC 审专变为梭形平滑肌样的细胞，融合后形成 峰谷排列，部分细胞表现为.a染色阳性，胞浆呈现棕黄色。随机计数 10 个视野计算诱导分化率为（45.6 3.5） %未进行诱导的 MSCi 亦有少 量细胞a染色阳性（3.8 0.77） %2.2HAAM 检测将经物理和酶处理的 HAAM 做 HE 染色，置光学显微镜下观察，可见大量浅 红色胶原纤维未受损，无蓝染核物质，表面没有残留的细胞碎屑。扫描电镜下 HAAM 表面粗糙，一面为网状纤维结构，孔隙较多，大

12、小不一。两面均无细胞残 留（图 1）。HAAM 浸提液组细胞平均相对增殖率为 88%毒性评分为I级（表 1），证明所制备的 HAAMfl 织相容性好，符合生物材料应用要求。表1 细胞相对增殖率和细胞毒性分级（略）2.3组织工程膀胱构建复合培养 36 h 后 HE 染色观察可见 HAAM 材料上生长的细胞，部分融入支架 材料内；扫描电镜下可见 MSCs 生长良好，且有突起伸出固定于周围支架材料（图 1）。2.4大鼠重建膀胱的大体观察及容量测定A、B、C 二组术后 1 w 内分别死亡 5 只、4 只和 1 只，均死于尿外渗和膀胱 周围感染。另外 A、B 两组均有一只动物有明显尿外渗（腹腔肿大），但

13、未死 亡，后尿外渗逐渐好转。术后 2w 时重建膀胱被大网膜包绕，仔细分离后可见 标记线内膀胱已愈合良好，但较薄，不能辨认出HAAM 4、8 w 时仍可见局部黏连，A B两组膀胱已达正常膀胱外观，C 组膀胱明显缩小，局部黏连比A B两 组轻微。2 w 时 A 组大鼠膀胱的 Volmax 为（1.21 0.60） ml ，B 组为（1.12 0.53） ml，两组比较无统计学意义（P0.05 ），C 组（0.75 0.41） ml,与 A、B 两组比较均有显著差别（PV0.05）。随时间延长，4、8 w 时大鼠的膀胱 容量略有增加但两组仍无差别。 8 w 时膀胱造影见 A、 B 两组重建的膀胱与正

14、常 膀胱相似，C 组膀胱明显缩小（表 2、图 2）。2.5重建膀胱的组织学观察A 组和 B 组术后 2 w 时 HAAM 修复区已有上皮细胞和膀胱平滑肌细胞形成，但 B组平滑肌和上皮层较薄，平滑肌不规则，A 组则上皮层和平滑肌略厚，相对规则。两组均有嗜酸细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润（图3）; 4 和 8 w 时两组已经与正常膀胱组织无明显区别。C 组 2w 时切口区仅轻微炎性细胞浸润，无其他异常。表 2 手术各组术后不同时间 Volmax 的测定结果（略）3讨 论组织工程学是近年来新兴起的一门学科，受到了科学界的广泛关注。其 核心是利用组织工程学技术与生命科学的成果，将活细胞与生物材料结合，修

15、 复、重建、维持、恢复或提高人体组织的功能5。组织工程的理想支架材料 应该具备如下条件：有良好的组织相容性；生物可降解性；无免疫原 性；具有多孔性和高空隙率，利于细胞的贴附和生长，诱导组织再生；可 塑性；有一定机械强度。而 HAAM 作为一种天然细胞外基质生物材料，几乎具 备以上各种生物特性，最有可能在组织体内完全再生，并可负载细胞生长。 Meller 6将结膜细胞种植于羊膜上，BrdU 标记后植入无胸腺鼠皮下，植入 后 14 d 可以追踪到 84%勺标记细胞，同时其他指标也显示黏附于羊膜上的细胞 具有干细胞特点，表明羊膜为干细胞提供了有利环境。本实验应用去污剂洗涤 和酶消化的方法获得 HAA

16、 M 经过光镜和电镜检查，完全去除了细胞碎屑，降低 了细胞免疫原性，又不损害 HAAM 勺胶原成分，采用 MTT 法进行了细胞相对增殖 性测定，细胞相对增殖率80%细胞毒性I级，符合生物材料的应用要求，因此是理想的支架材料。稳定可靠迅速地获取充足的有活力的细胞源是组织工程的另一个重要问 题。目前膀胱组织工程中常用的种子细胞为膀胱移行上皮细胞和膀胱平滑肌细 胞，进行支架材料双面种植7。但是上皮细胞和膀胱平滑肌细胞取材培养困 难，且体外扩增传代有限，双面种植较为困难。MSC 是来源于中胚层的一类干细胞，主要存在于骨髓及其他结缔组织，不仅具有向中胚层分化的能力，而且 具有向内胚层和神经外胚层来源的组

17、织细胞分化的能力，在特定条件下可定向 分化为骨、肌肉、血管内皮和神经等多种终末功能的细胞，参与自身组织细胞 的更新、再生、修复和分化 2 。 杨景全等报道 8 ， 大鼠脊髓匀浆上清液 可在体外有效地诱导骨髓 MSCi分化为神经样细胞。受此启发，我们利用膀胱组 织匀浆上清液和 DMS 附 MSCs 在体外进行诱导分化为平滑肌样细胞，经a平 滑肌肌动蛋白抗体检测，诱导分化率将近50%因此可作为种子细胞进行种 植。各种资料及临床经验提示，移行上皮具有很强的再生及修复能力，因此本 实验未专门进行上皮细胞的种植。实际上，在体内微环境的影响下，部分MSCs亦有自主向上皮细胞转化的可能。MSCs与 HAAM

18、t体外短暂培养2436 h即可完成体外组织工程膀胱的 构建，扫描电镜检查可见细胞黏附固定在支架材料上。 重建膀胱的组织学显 示，2 w 时 HAAN移植物即已降解吸收，移行上皮和膀胱平滑肌开始形成。无论 单独使用 HAAM 还是使用 MSCs/HAA 复合物进行膀胱替代，均没有发生移植排斥 和坏死反应。比文献报道的应用无细胞膀胱基质（厚约 0.3 cm ）进行膀胱替代 吸收要早，炎性反应要轻微。表明 HAAMfl 织相容性好，降解吸收快速完全且排 斥反应轻微。虽然 A、B 两组在膀胱容量上没有显著性差别，但组织学显示应用 MSCs/HAA 复合物修补的膀胱修补区肌肉组织再生比较完全，其膀胱动力

19、学功 能可能要优于单独应用 HAAMS 行修补的膀胱。这需要进一步的实验来证实。无 论如何，与单纯缝合而不用任何生物材料的 C 组相比，A、B 两组膀胱容量明显 较大，证实 HAAM 移植比单纯缝合膀胱更能维持其生理功能。本实验表明，负载了以 MSCs 乍为种子细胞 HAAM!较理想的组织工程膀 胱材料，具有良好的应用前景。【参考文献】1 Yoo JJ，Oberpenning F，Atala A.BIadder augmentation using alloge nicbladder submucosa seeded with cellsJ2 Bia neo P , Rimi nucci M,G on thos S,et al.B one marrow stromal stem cells ,nature , bio