生物芯片的数据处理及应用

1、LOGO生物芯片的数生物芯片的数据处理及应用据处理及应用 2013.11.11 李丹李丹 生物芯片的数据处理及应用生物芯片的数据处理及应用v 生物芯片作为一种高通量的技术平台为探索生物的复杂生物芯片作为一种高通量的技术平台为探索生物的复杂性提供了强有力的工具性提供了强有力的工具。在在生命科学、药物研发、临床疾生命科学、药物研发、临床疾病检测和诊断病检测和诊断、环境、农林业环境、农林业等领域都得到了广泛的应用等领域都得到了广泛的应用。通过生物芯片的一次检测，可以产生大量的数据。通过生物芯片的一次检测，可以产生大量的数据。如何如何在浩瀚如海的芯片数据中，通过有效的数据处理和分析方在浩瀚如海的芯片数

2、据中，通过有效的数据处理和分析方法法。发现基因表达，基因的结构和基因功能可能存在的联发现基因表达，基因的结构和基因功能可能存在的联系，将无机的数据信息与有机的生命活动联系起来，阐释系，将无机的数据信息与有机的生命活动联系起来，阐释生命的特征和规律以及基因的功能，是生物信息学研究的生命的特征和规律以及基因的功能，是生物信息学研究的重要课题重要课题。Contents生物芯片的原理（基因芯片甲基化芯片）生物芯片的原理（基因芯片甲基化芯片）1芯片芯片数据数据预处理预处理2差异基因筛选差异基因筛选3基因功能注释与功能富集分析基因功能注释与功能富集分析4基因芯片的应用基因芯片的应用5R, G一、基因一、基

3、因芯片的检测原理芯片的检测原理最根本的原理：碱基互补配对原则 核酸分子特异性杂交基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息通过杂交检测信息该技术实现了在微芯片固相载体上对大量目的DNA的特异杂交检测，具有高通量、多样化、微量化、集成化、自动化等显著优点，在生物学领域具有十分广泛的应用前景。一、一、基因芯片实验流程基因芯片实验流程v甲基化特异性内切酶甲基化特异性内切酶v蛋白或抗体富集（蛋白或抗体富集（MeDIP） Nimblegen和Agilent公司的甲基化芯片：不能精确定量

4、、无法提供单碱基分辨率、假阴性和假阳性较高、需要高达10ug的DNA、价格高昂等v重亚硫酸盐修饰（重亚硫酸盐修饰（Bisulfite Modification） Illumina公司的甲基化芯片：可提供单碱基分辨率并可精确定量v GoldenGate Panel Iv HumanMethylation27K BeadChip 14495个基因启动子和转录起始位点附近的 27,578个CpG位点v HumanMethylation450K BeadChip 可检测全基因组450000多个CpG位点; 96%的CpG岛； CpG岛以外的CpG位点 （启动子区、5UTR区、第一外显子区、gene b

5、ody区、3UTR区、基因间区域以及CpG岛外低密度分布的CpG位点）； 每张芯片可平行检测12个样本二、二、芯片芯片数据数据预处理预处理数据过滤 -背景校正、去除表达水平是负值或很小的数据或者明显的噪声数据数据转换 - 总量 or log重复数据合并缺失数据的处理- k 近邻，重复值，基因间的相 关性（行均值）数据标准化 - 实验/片内标准化，实验/片间标准化数据预处理一般流程数据预处理一般流程所有芯片最终都是根据扫描出来的荧光值来所有芯片最终都是根据扫描出来的荧光值来判定表达的强弱。因此芯片数据的处理方法判定表达的强弱。因此芯片数据的处理方法具有普遍适用性。包括具有普遍适用性。包括mRNA

6、，miRNA，LncRNA以及前面介绍的以及前面介绍的2种芯片。种芯片。v（一）背景的校正（一）背景的校正-预处理的第一步预处理的第一步v 原因原因：序列上点的荧光强度是由背景荧光和标记：序列上点的荧光强度是由背景荧光和标记DNA产生的荧光的共产生的荧光的共同作用，因此，为获取与真实量成比例的数值，应当减去对应于背景同作用，因此，为获取与真实量成比例的数值，应当减去对应于背景的荧光强度值，的荧光强度值，背景校正荧光强度背景校正荧光强度才真正反映了基因真实的水平。才真正反映了基因真实的水平。v 方法方法：v 1、局部背景校正、局部背景校正v 2、亚栅格背景校正、亚栅格背景校正v 3、分组背景校正

7、、分组背景校正v 4、空白点背景校正、空白点背景校正v 5、对照点背景校正（内参）、对照点背景校正（内参）（二）弱信号的处理（二）弱信号的处理原因原因：在芯片上存在很多弱信号点，这些点的信号强度虽然很弱，但可能：在芯片上存在很多弱信号点，这些点的信号强度虽然很弱，但可能 并不是低质量的点，因此不能武断地把弱信号点全部删除。并不是低质量的点，因此不能武断地把弱信号点全部删除。弱信号点的分类：弱信号点的分类：（1）噪声引起，当前景信号强度值接近背景信号强度值时，噪声会掩盖）噪声引起，当前景信号强度值接近背景信号强度值时，噪声会掩盖前景强度值，经过背景校正后得到的红绿荧光信号比值有较大波动。前景强度

8、值，经过背景校正后得到的红绿荧光信号比值有较大波动。（2）重要信息点，如一个通路起点的启动基因，只需要少量的表达就能）重要信息点，如一个通路起点的启动基因，只需要少量的表达就能激发和促进通路下游基因的表达，这些信号点真实地反映了基因表达激发和促进通路下游基因的表达，这些信号点真实地反映了基因表达的实际水平。的实际水平。v弱信号的处理方法：弱信号的处理方法：v 分离噪声和有价值意义的弱信号点分离噪声和有价值意义的弱信号点v （1）重复芯片实验：观察弱信号点的稳定性，从而判断其可信性。）重复芯片实验：观察弱信号点的稳定性，从而判断其可信性。 缺点：成本较高，提高芯片数据的复杂性缺点：成本较高，提高

9、芯片数据的复杂性 （2）找到一个适当的信号强度阈值，低于该值的点删掉，高于该值的）找到一个适当的信号强度阈值，低于该值的点删掉，高于该值的信号点认为是一些真正的弱信号点，应当进入后续的数据分析，挖掘信号点认为是一些真正的弱信号点，应当进入后续的数据分析，挖掘出具有生物意义的信息。出具有生物意义的信息。 信号强度阈值信号强度阈值 信噪比信噪比 通过背景、空白点或阴性对照点确定弱信号的阈值通过背景、空白点或阴性对照点确定弱信号的阈值 使用信号强度的累积分布函数确定阈值使用信号强度的累积分布函数确定阈值（三）数据的对数转换（三）数据的对数转换转换原因：转换原因：1、生物学上易于理解和解释、生物学上易

10、于理解和解释如:若两个基因在对照样本中的背景校正强度值均为1000，而在另外一个实验条件下的背景校正强度值分别为100，10000，从绝对值上看，相差很大，但其实各自发生了10倍的变化。取对数： lg100=2, lg1000=3, lg10000=4 对数变换减弱了方差和平均值，使低强度值处的倍数改变与高强度值处发生的倍数改变具有可比性。2、使数据的分布满足对称性和近似正态分布、满足常用统计分析方法、使数据的分布满足对称性和近似正态分布、满足常用统计分析方法3、使用的方便性、使用的方便性如：如果使用以2为底的对数，要选择具有4倍以上变化的基因可以在比值直方图的log2比值为2处截图数据转换数

11、据转换- log2Ratio使数据的分布满足对称性和近似正态分布，满足常用统计分析方法- oligo 芯片（Affymetrix）在寡核苷酸单色实验中，结果是基因表达的荧光信号强度（四）重复数据合并（四）重复数据合并 重复能减少统计量的变异，从重复芯片得到的数据可以使用正规的统计方法进行分析。只有重复才能计算均数，而均数比单个值具有更强的稳定性。重复的类型重复的类型 - 单张芯片上的重复，有意设计的重复点（重复点在单张芯片上应合理布局，这样能较好地反映一张芯片上的变异，而不应把重复点排列在一起） - 不同芯片的重复（1）技术重复，（2）生物学重复技术重复不能提供数据的独立性，即使对重复进行平均

12、，重复间相同的系统效应仍然存在。而生物学重复能提供更为独立的实验结果重复数据的合并 - 均值或中位数或众数，集中趋势指标（常用，要掌握）（五）缺失数据的处理（五）缺失数据的处理(一一)数据缺失类型数据缺失类型 非随机缺失非随机缺失 基因表达丰度过高或过低基因表达丰度过高或过低 随机缺失随机缺失 与基因表达丰度无关，数据与基因表达丰度无关，数据 补缺主要针对随机缺失情况补缺主要针对随机缺失情况(二二)数据补缺方法数据补缺方法当点为空点或相对背景强度高于绝对信号强度时,该点的数据出现缺失。由于缺失值容易干扰统计学分析或影响基因聚类的稳定性。会导致下游数据分析出现问题,一般会采用特定的数值来代替缺失

13、值。 k近邻法近邻法n选择与具有缺失值基因的选择与具有缺失值基因的k k个邻居基因个邻居基因n用邻居基因的加权平均估计缺失值用邻居基因的加权平均估计缺失值参数参数: :n邻居个数邻居个数n距离函数距离函数（六）数据的标准化（归一化）（六）数据的标准化（归一化）芯片实验的变异芯片实验的变异=系统变异系统变异+随机变异随机变异系统变异系统变异=生物学差异生物学差异+系统误差系统误差标准化的目的就是消除系统误差，使不同次实验具有可比性标准化的目的就是消除系统误差，使不同次实验具有可比性引起系统误差的因素包括：引起系统误差的因素包括：荧光物质的物理和化学属性，荧光物质的物理和化学属性，cy3和和cy5

14、的染色效率差异的染色效率差异芯片的制作（不同点样头间的差异，芯片的空间位置不同）芯片的制作（不同点样头间的差异，芯片的空间位置不同）1.芯片的扫描过程（扫描仪的属性设置）芯片的扫描过程（扫描仪的属性设置）用于归一化的非差异表达基因的选择用于归一化的非差异表达基因的选择- 全部基因、管家基因全部基因、管家基因全部基因全部基因假设假设：（：（1）染色体）染色体/基因组范围的检测时，仅有比例非常小的基因在基因组范围的检测时，仅有比例非常小的基因在两个样品中的表达有差异两个样品中的表达有差异（2）上调和下调基因的表达水平具有对称性，当芯片上的基因数目）上调和下调基因的表达水平具有对称性，当芯片上的基因

15、数目很大，通常大于很大，通常大于5000时在各种实验条件下具有差异的基因数目时在各种实验条件下具有差异的基因数目不超过不超过10%局限性：生物样品的表达量上确实存在差异，因此用全局基因或绝局限性：生物样品的表达量上确实存在差异，因此用全局基因或绝大多数基因（对表达水平两端的数据截尾），进行归一化，在大多数基因（对表达水平两端的数据截尾），进行归一化，在准确性上受到一定程度的限制。准确性上受到一定程度的限制。管家基因管家基因/持家基因持家基因定义：在各种条件下具有稳定表达的基因定义：在各种条件下具有稳定表达的基因局限性：局限性：管家基因的表达也有变化管家基因的表达也有变化管家基因的确定困难（条件

16、特异的）管家基因的确定困难（条件特异的）管家基因一般具有较高的表达强度，因此对低表达基因的归一化管家基因一般具有较高的表达强度，因此对低表达基因的归一化效果不好效果不好归一化方法的分类归一化方法的分类- 序列内的归一化（片内标准化）序列内的归一化（片内标准化）- 染色互换配对设计的芯片的归一化染色互换配对设计的芯片的归一化- 多张芯片间的归一化（片间标准化）多张芯片间的归一化（片间标准化）片内标准化（片内标准化（cDNA芯片芯片lowess标准化）标准化）Lowess Normalization 目前实验室常用的芯片为单通道的寡核苷酸芯片，对于affymetrix公司的寡核苷酸芯片，实验室最常

17、用的预处理算法为RMA三、三、差异基因筛选差异基因筛选v 差异表达基因也可以称为阳性基因，包括上调差异表达基因也可以称为阳性基因，包括上调表达基因和下调表达基因，通常采用基因在实验表达基因和下调表达基因，通常采用基因在实验组和对照组中信号的比值衡量基因在两种状态下组和对照组中信号的比值衡量基因在两种状态下基因的表达差异。基因的表达差异。三、三、差异基因筛选差异基因筛选1、倍数法、倍数法实验条件下的表达值（荧光强度值）对照条件下的表达值（荧光强度值）通常以2倍差异为阈值，判断基因是否差异表达通常大于2或者小于0.5即认为表达有差异这个筛选标准是可以改变的，如（0.333，3），（0.667，1.

18、5）这种方法简单、直观。但是其阈值的划分主观性较强，未考虑到生物学变异和实验系统误差，缺乏生物学和统计学支持。这种方法适用于预实验和实验初筛，或辅助其他差异基因筛选方法。2、t检验法检验法 运用t检验法可以判断基因在两种不同条件下的表达差异是否具有显著性零假设H0：1=2，即假设某基因在两种不同条件下的平均表达水平相等备择假设H1：1！=2在实际操作中在实际操作中，经常经常结合结合t检验分析和检验分析和倍数分析倍数分析对数据进行筛选。火山图对数据进行筛选。火山图(Volcanoplot右图右图)是用是用p-value值与值与fold change值两个因素共同绘制的，用于显值两个因素共同绘制的

19、，用于显示两组样品数据的显著性差异。通常当示两组样品数据的显著性差异。通常当p-value0.05且且Foldchange2时，我们认时，我们认为这些基因在两组样品中具有显著性差异为这些基因在两组样品中具有显著性差异。3、SAM (significance analysis of microarrays)(一一) 多重假设检验问题多重假设检验问题 型错误（假阳性）即在假设检验作推断结论时，拒绝了实际上正确的检验假设，即将无差异表达的基因判断为差异表达。 型错误（假阴性）即不拒绝实际上不正确的，即将有差异表达的基因判断为无差异表达。 在进行差异基因挑选时，整个差异基因筛选过程需要做成千上万次假设

20、检验，导致假阳性率的累积增大。对于这种多重假设检验带来的放大的假阳性率，需要进行纠正。常用的纠正策略有Bonferroni效正，控制FDR（false discovery rate）值等。Bonferroni(邦弗朗尼邦弗朗尼)校正校正 如果在同一数据集上同时检验n个独立的假设，那么用于每一假设的统计显著水平，应为仅检验一个假设时的显著水平的1/n。Benjamini于1995年提出一种方法,通过控制FDR(False Discovery Rate)来决定P值的域值. 假设你挑选了R个差异表达的基因，其中有S个是真正有差异表达的，另外有V个其实是没有差异表达的，是假阳性的。实践中希望错误比例Q

21、=V/R平均而言不 能超过某个预先设定的值（比如0.05），在统计学上，这也就等价于控制FDR不能超过5%。设总共有m个候选基因，每个基因对应的p值从小到大排列分别是 p(1),p(2),.,p(m)，则若想控制fdr不能超过q，则只需找到最大的正整数i，使得 p(i)= (i*q)/m.然后，挑选对应p(1),p(2),.,p(i)的基因做为差异表达基因，这样就能从统计学上保证fdr不超过q。筛选差异基因后需要做进一步的研究和分析筛选差异基因后需要做进一步的研究和分析1.筛选分子标志物2.选择自己感兴趣的基因，做实验室的确证3.利用数据库，做功能分析（基因功能及通路功能富集）4.预测分子通路

22、5.基因和蛋白质相互作用分析四、基因注释与功能富集分析四、基因注释与功能富集分析（一）基因注释数据库（一）基因注释数据库 GO数据库 KEGG数据库（二）功能富集分析（二）功能富集分析 超几何分布 富集分析软件BiNGOGO-function（一）基因注释数据库（一）基因注释数据库1、研究人员已经掌握了大量的、研究人员已经掌握了大量的全基因组数据全基因组数据，同时关于，同时关于基因基因、基因产物基因产物以及以及生物学通路生物学通路的数据也越来越多，解释生物学实验的结果，尤其从的数据也越来越多，解释生物学实验的结果，尤其从基因组角度，需要系统的方法。基因组角度，需要系统的方法。 2、在基因组范围

23、内、在基因组范围内描述蛋白质功能描述蛋白质功能十分复杂，最好的工具就是计算机十分复杂，最好的工具就是计算机程序，提供结构化的标准的生物学模型，以便计算机程序进行分析，程序，提供结构化的标准的生物学模型，以便计算机程序进行分析，成为从整体水平系统研究基因及其产物的一项基本需求。成为从整体水平系统研究基因及其产物的一项基本需求。 基因注释数据库产生的原因基因注释数据库产生的原因1 1、基因本体（基因本体（gene ontology, GOgene ontology, GO）数据库）数据库 基因本体数据库是GO组织（Gene Ontology Consortium）在2000年构建的一个结构化的标准

24、的标准生物学模型，旨在建立基因及其产物知识的标准词汇体系，涵盖了基因的细胞组分（细胞组分（cellular component）、分子功能（）、分子功能（molecular function）、生物学过生物学过程（程（biological process）。 GO注释体系特点注释体系特点v GO通过控制注释词汇的层次结构使得研究人员能够从不同层面查询和使用通过控制注释词汇的层次结构使得研究人员能够从不同层面查询和使用基因注释信息。基因注释信息。v 从整体上来看从整体上来看GO注释系统是一个有向无环图注释系统是一个有向无环图(Directed Acyclic Graphs),包含包含三个分支三个

25、分支,即即: 生物学过程生物学过程(biological process)，分子功能，分子功能(molecular function)和细胞组分和细胞组分(cellular component)。v 注释系统中每一个结点注释系统中每一个结点(node)都是基因或蛋白的一种描述都是基因或蛋白的一种描述,结点之间保持严格结点之间保持严格的关系的关系,即即“is a”或或“part of”。24th Feb 2006 Jane Lomaxcellmembrane chloroplastmitochondrial chloroplastmembrane membraneis-apart-of膜膜 叶绿

26、体叶绿体线粒体膜线粒体膜 叶绿体膜叶绿体膜 细胞细胞 Ontology Structure(本体结构本体结构)神经源性分化因子6（NEUROD6）NEUROD6gene and proteinsexact match举例举例 人民卫生出版社8年制及7年制临床医学等专业用生物信息学此图显示了该基因产物的基本信息，包括类型、物种、此图显示了该基因产物的基本信息，包括类型、物种、别名来源和序列别名来源和序列 此图显示了该基因产物此图显示了该基因产物的术语关联（的术语关联（term associations）图，图中）图，图中记录名称记录名称“Term”是是GO记录的名字，记录的名字，“Ontolog

27、y”是该基因是该基因产物的特性，如要查看产物的特性，如要查看其分子功能，可点击其其分子功能，可点击其中的一条记录中的一条记录“nervous system development”。 此图上部先对神经源性分化此图上部先对神经源性分化因子因子6的相关信息做简单描的相关信息做简单描述，中间述，中间术语系谱（术语系谱（term lineage）成阶梯状分布，记成阶梯状分布，记录了录了GO数据库中全部分子数据库中全部分子功能所处的位置和关系。下功能所处的位置和关系。下方方“External Reference”提提供了与外部相关数据的链接。供了与外部相关数据的链接。 点击上图右上方的可视化视图（gra

28、phical view）就更清晰地显示了分子功能记录之间构成的复杂网状结构，既有上下隶属关系，也存在平行关系。v 京都基因与基因组百科全书京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 是系统分析基因功能、基因组信息是系统分析基因功能、基因组信息的数据库，它整合了的数据库，它整合了基因组学基因组学、生物化学生物化学以及以及系统功能组系统功能组学学的信息，有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体的信息，有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。网络进行研究。v KEGG提供的提供的整合代谢途径查询整合代谢途径查询

29、十分出色，包括碳水化合十分出色，包括碳水化合物、核苷酸、氨基酸等代谢及有机物的生物降解，不仅提物、核苷酸、氨基酸等代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的代谢途径，还对催化各步反应的酶进行了供了所有可能的代谢途径，还对催化各步反应的酶进行了全面的注解，包含其氨基酸序列、到全面的注解，包含其氨基酸序列、到PDB数据库的链接等。数据库的链接等。此外，此外，KEGG还提供基于还提供基于Java的图形工具访问基因组图谱、的图形工具访问基因组图谱、比较基因组图谱和操作表达图谱，以及其他序列比较、图比较基因组图谱和操作表达图谱，以及其他序列比较、图形比较和通路计算的工具。因此，形比较和通路计算的工具。

30、因此，KEGG数据库是进行数据库是进行生生物体内代谢分析、代谢网络分析物体内代谢分析、代谢网络分析等研究的强有力工具之一。等研究的强有力工具之一。2 2、KEGG(KEGG(京都基因与基因组百科全书京都基因与基因组百科全书) )v KEGG目前共包含了目前共包含了18个子数据库，它们被分类成系统信个子数据库，它们被分类成系统信息、基因组信息和化学信息三个类别息、基因组信息和化学信息三个类别 。KEGG存储内容存储内容 PATHWAY数据库储存了基因功能的相关信息，通过图形来表示细胞内的生物学过程，例如代谢，膜运输，信号传导和细胞的生长周期。 基因组信息存储在GENES数据库里，包括全部完整的基

31、因组序列和部分测序的基因组序列，并伴有实时更新的基因相关功能的注释。 KEGG中化学信息的5个数据库被称为KEGG LIGAND数据库，包含化学物质、酶分子、酶化反应等信息。KEGG BRITE数据库是一个包含多个生物学对象的基于功能进行等级划分的本体论数据库，它包括分子、细胞、物种、疾病、药物、以及它们之间的关系。 一些小的通路模块被存储在MODULE数据库中，该数据库还存储了其他的一些相关功能的模块以及化合物信息。 KEGG DRUG数据库存储了目前在日本所有非处方药和美国的大部分处方药品。 KEGG DISEASE是一个存储疾病基因、通路、药物、以及疾病诊断标记等信息的新型数据库。 输入

32、syn:ssr3451KEGG PathwayKEGG通路符号注释通路符号注释SummaryvKEGG数据库包含多个子数据库，全方位地对基数据库包含多个子数据库，全方位地对基因进行了注释因进行了注释。vKEGG Pathway数据库包含了各种代谢途径的信数据库包含了各种代谢途径的信息，并提供息，并提供KGML格式下载格式下载基因芯片数据感兴趣基因(差异表达基因)背景基因显著性计算显著的基因功能集合（具有显著性的功能或通路）（二）功能富集分析流程（二）功能富集分析流程1、富集分析统计原理、富集分析统计原理v富集分析方法通常是分析一组基因在某个功能结富集分析方法通常是分析一组基因在某个功能结点上是

33、否点上是否过出现过出现(over-presentation)。v即，一组基因与该功能结点的注释基因的交叠是即，一组基因与该功能结点的注释基因的交叠是否否非随机的多非随机的多。v通常使用超几何分布型来检验一组基因通常使用超几何分布型来检验一组基因(如差异表如差异表达的基因达的基因) 在某个功能类的显著性。在某个功能类的显著性。超几何分布超几何分布v若若M件产品中有件产品中有K件次品，则随机抽取件次品，则随机抽取N次（不放次（不放回），抽取到次品数回），抽取到次品数X大于等于大于等于y的概率是的概率是:10K)()(1) 1()(yxMNKMxNxyXPyXPMNKy假设假设 M=1000，K=200， N=100， y=50，则：，则：13-8.6597e )()(1)50(490