感受态细胞的制备

1、(1) 0.1mol/L CaCI2 溶液(2) LB液体培养基 在950 ml去离子水中加入：胰化蛋白胨10g,酵母提取物 5g, NaCI 10g , 摇动容器直至溶质溶解用5mol/LNaOH调pH至74用去离子水定容至 1L.(3) 30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。主要设备(1) 超净工作台(2) 冷冻离心机(3) 恒温摇床70 C冰箱(5) 10mL移液管(6) 吸耳球(7) 1mL、200卩L移液枪(配套枪头)(8) 50mL离心管(9) 1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌 DH5 a( R-, M- , Amp-)实验步骤(一) 受体菌的培养(1)从L

2、B平板上挑取新活化的 E. coli DH5 a单菌落，接种于35mL LB液体培养基中，37 C 下振荡培养过夜(12h左右)。将该菌种悬液以1:100的比例接种，取450卩L菌液转接到45mL LB液体培养基中，37 C 振荡培养 23h至OD600 = 0.5左右。(二) 感受态细胞的制备(注意：以下操作在超净工作台完成。)(1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置 10min。在4C下，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液18mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。(4) 04 C 4000r/min离心

3、10min，弃去上清，加入 4mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻 轻悬浮细胞，冰上放置(务必冰上放置)。（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）（三）感受态细胞的分装与冻存（1）在4mL制备好的感受态细胞中加入4mL 30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。（2）将此感受态细胞分装成每份200卩L （1.5mL dorf管）,液氮速冻，快速转入-70C冰箱保存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70C冰箱保存。）注意事项、细胞的生长状态和密度最好从-70C或-20C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4C的培养菌液

4、。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5X 107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的 0D600控制。对TG1菌株，0D600为0. 5时，细胞密度在 5X 107个/ml左右。（应注意 0D600值与细胞 数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且 受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。、试剂的质量所用的CaCI2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4C。、防止杂菌和杂 DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的， 并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入。、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。固体LB培养基：在950 ml去离子水中加入：胰化蛋白胨10g，酵母提取物 5g , NaCl 10g , 摇动容器直至溶质溶解用5mol/LNaOH调pH至7.4.用去