生物工程下游技术色谱分离

1、Chapter 7色谱分离色谱分离(层析分离层析分离) (CR) Chromatographic Resolution 7.1 概述概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，利用多组分混合物中各组分物理化学性质(如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等)的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物化性质的差异而以不同的速率移动，使之分离-经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。Chromatography Techniques 俄国植物学家茨维特在俄国植物学家茨维特在1906

2、1906年使用的装置：年使用的装置：色谱原型装置，如图色谱原型装置，如图他将植物叶子的色素通他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为由此得名为“色谱法色谱法”（Chromatography)Chromatography) 色谱法是一种分离技术色谱法是一种分离技术 试样混合物的分离过程也就是试样中各组试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。分配过程。 其中的一相固定不动，称为

3、其中的一相固定不动，称为固定相固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流体（气体或液体），称为流动相流动相。色谱分离的特点色谱分离方法的分类按原理不同分： 吸附色谱(Adsorption C.)：吸附力不同(物理、化学) 分配色谱(Distribution C.)：分配系数不同 离子交换色谱(IEC)：离子交换树脂的化学亲和力差 凝胶色谱：分子大小或形状不同(Gel C.)分子筛色谱 亲和色谱(Affinity C.)：生物大分子的专一结合能力 柱色谱分离(Colum C.)填料 纸上色谱分离(PC)滤纸作为载体 薄层色谱(TL

4、C)： 上两个结合，分析用 凝胶色谱：凝胶为载体 气相色谱GC能气化的物质 液相色谱LPC 超临界色谱SFC流动相SFCO2 低(，当连续加入洗脱剂，且柱有足够长度，则混合物中三种组分逐渐分开，分子跑在最前面，最先从柱中洗出； 2)展开(development)：加入洗脱剂使各组分分开的操作 3)色谱图(chromatogram)：展开后各组分的分布情况 GelFiltrationIonExchangeHydrophobic InteractionAffinity Reversed PhasePrinciples of Operation for Chromatography Techniqu

5、es7.2.2 色谱分离的分配机理可由Langmuir方程得出Kd-分配系数，反应了消耗在固定相上的时间及在柱中的停留时间。 q、c-溶质在固相和液相中的浓度cqKd保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一阻滞因子Rt阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小迁移距离流动相在色谱系统中的溶质的迁移距离fRsdmmfAKAAR洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所

6、差异sdmeVKVV色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N-理论塔板数 tR-保留时间W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度理论塔板高度： L-柱长22/1)(54. 5WtNR2)(16bRWtN NLH Rs = 4Rs = 0.6Rs = 1RVVWWsrr21122Resolution = Peak separation Peak width at heightResolution factor RsHigh efficiencyLow efficiencyHigh selectivityLower selectivit

7、y: q Is a measure of peak widthq High efficiency means sharp peaksq High efficiency means a good packed columnq High efficiency can compensate for low selectivity:q Is a measure of peak separationq High selectivity gives baseline separationsq If selectivity is high, low efficiency can be tolerated (

8、if large peak volume is acceptable).Resolution: depends on efficiency and selectivity N = Number of theoretical platesEfficiency: the quality of your columnWh = Peak width at half peak heightVrAU280N = 5.54 (V )Wh 2Testsolution: 1% acetone (about 0.5% of column volume), 0.2 AUFS at 280 nm. Alternati

9、vely use 2 M NaCl and conductivity monitor.HETP = L/N HETP = Height equivalent of theoretical plates L = Length of packed column bedEfficiencyEfficiency depends on: nParticle size of matrixnParticle size distribution of matrixnPacking quality of the columnnSample (volume and viscosity)nFlow rate7.3.

10、1 吸附色谱(absorption chromatography)原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离关键要素：吸附剂和展开剂的选择吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH27.3 各种色谱分离技术常用的吸附剂：氧化铝 硅胶活性炭纤维素聚酰胺硅藻土展开剂的选择展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果展开剂选择的原则：（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（2）展开剂应对被分离物

11、质具有一定的溶解能力 吸附色谱涉及吸附剂、被分离化合物和展开剂三者之间的相互竞争，到目前为止还只是凭经验来选择。三角形图解法可初步估计： 应用举例：丝裂霉素的精制。丝裂霉素的发酵滤液用活性炭吸附，丙酮洗脱，蒸去丙酮的浓缩水溶液，用氯仿萃取。氯仿萃取液上氧化铝柱，先用氯仿冲洗，能部分分带，接着以氯仿-丙酮(3：2)展开，约2h后，能分图示的色带。其中蓝紫色色带d为有效成分丝裂霉素C。将柱推出,切取蓝紫色部分，用10%甲醇-氯仿洗脱，减压蒸干，在甲醇-苯中结晶，即可得蓝紫色丝裂霉素C结晶。一般吸附色谱的操作程序一般吸附色谱的操作程序根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相

12、和流动相吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物7.3.2 分配色谱 (partition chromatography)原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法要素：固定相、载体、流动相载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：硅胶硅藻土纤维素葡聚糖凝胶固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱）*反相色谱 固定相是非极性的流动相是极性的应用举例：6.3.3 HPLC

13、HPLC Chromatogram反相液相色谱反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性载体：微粒多孔硅胶（粒径5m20 m ） Hypersil Spherosil XOB075固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃Source RPC30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separat

14、ion effectWhy use reversed phase ?RPC gives the highest resolutionSimple eluents: water and organic solventsEasy manipulation of resolution by changing parametersRemoving specific contaminantsUnfortunately denaturing for larger proteins6.3.4离子交换色谱(ion exchange chromatography) 利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，

15、将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。Why use ion exchange?Useful at all stages of purification and at all scalesControllableHigh selectivityHigh capacityConcentratingHigh recovery常用的离子交换树脂葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25纤维素系列离子交

16、换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetaseSDS-PAGEStarting

17、 materialPeak 26.3.5分子筛凝胶色谱(GFC)利用相对分子质量差进行分离的色谱分离技术。大分子质量者先洗脱出(先出峰)。(又称为排阻色谱) 优点：操作简便分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐分辨率低分子筛凝胶色谱原理分子筛凝胶色谱原理凝胶装置图色谱峰和分离结果洗脱体积洗脱体积Pros lFastest for buffer exchangelVery gentle, high yieldslWorks in any buffer solutionlRemoves dimers and aggregateslSeparates b

18、y sizeConslLimited sample volumelPoor selectivity compared with SDS-PAGEWhy use gel filtration?Desalting proteinsproteinssalts凝胶色谱填料凝胶色谱填料葡聚糖凝胶Sephadex G-系列聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列琼脂糖凝胶Sepharose系列Superose系列应用：应用： 分子量的测定分子量的测定蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关量有关:LogMLogM=k=k1 1-k-k2 2VeVe （VeVe为

19、洗脱体积）为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的VeVe，并以其分子量对数对，并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出作图得一直线，再测出待测样品的待测样品的VeVe，查标准曲，查标准曲线即可确定分子量。线即可确定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测除抗原性杂质(如青霉素致敏原)青霉素致敏原因是由于产品中存在一些高分子杂质，如青霉素聚合物，或青霉素降解产物青霉烯酸与蛋白质相结合而形成的青霉噻唑蛋白，具有强烈致敏性的全抗原。这种高分子杂质可用凝胶色谱法分离，方案如下：取葡聚糖凝胶G-25，粒度为2080m。色谱柱直径1.7cm，高37c

20、m，带有冷却夹套，冷却水温度为810。展开剂采用pH=7.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。样品加入量为凝胶床体积的4%10%。青霉素浓度为1：1.2或1：1.5(即1g青霉素溶于1.2mL或1.5mL缓冲液中)，流速lmL/3min，每5mL收集一管洗脱液。分出的高分子杂质有噻唑基反应。7.3.6疏水作用层析疏水作用层析(Hydrophobic Interaction Chromatography）Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomole

21、cules according to their hydrophobicity 利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。A 2800.04 AUNa2SO41.0 M疏水层析操作疏水层析操作Why use hydrophobic interaction ?oComplementary to ion exchange (IEX) and gel filtration (GF)oMild, non-denaturingoHigh selectivity oHigh recoveryoConcentrating technique7.3

22、.7亲和色谱亲和色谱（Affinity chromatography）在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体载体活化、配基连接、吸附、洗脱AC ver 99032630Steric considerations &spacer armsSmall ligand ( 95 % purity in one stepIsolate pure targ

23、et substance from excess amounts of contaminantsRemoves specific contaminantsFast separations 7.3.8金属螯合层析(metal chelating chromatography) 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。金属螯合层析技术在现代基因工程中常用金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分离于表达蛋白的分离NH2NH2NiH

24、isHisHisHisprotein7.3.9蛋白质分离常用的色谱方法免疫亲和层析属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和层析介质的获得：（1）获得抗体（2）抗体连接到载体上疏水层析在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。操作要点蛋白质的局部变性洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段操作要点：由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定由于蛋白质的极性基团很

25、多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在1020m mol层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整洗脱方式：pH梯度 离子强度梯度AIEXTechniqueUltrafiltrationUFSuperdex 200 p.g.GFPurificationfactorQ Sepharose FF 10 times purification 82% yieldPhenyl Sepharose HPHICY.-F. Liao et al. (1996)J. Biol. Ch

26、em. 271, 2834863622719Purification of recombinant a a-mannosidase from Pichia pastorisAKTA explorer 100色谱系统色谱系统AKTA explorer 100色谱系统工作流色谱系统工作流程程7.3.11纸层析纸层析是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析介质：滤纸操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹展开剂的选择展开剂的选择展开剂可以是单一溶剂，也可

27、以是混合溶剂常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2）展开方式：上行色谱下行色谱径向色谱7.3.12薄层色谱法薄层色谱法将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法常用的固定相有： 硅胶和氧化铝优点：设备简单、操作方便快速显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色灵敏度高（较纸层析）可以大量制备多肽的分离纯化多肽的分离纯化5 / S. Renlund: Peptides from all sources/ ver. 3.1, 980610Separation techniquesPeptideProteinRPCGFIEXIEXGFRPCPeptides fr

28、om All SourcesPeptides from All SourcesHow does a peptide differ from a protein?Speaker s notes:wRPC -reversed phase chromatography the by far most frequent technique for peptide purificationwSize of letters meant to reflect the frequency of the technique. wNext comes IEX - ion exchange chromatograp

29、hywGF gel filtration comes last - but it may be a underutilized technique12 / S. Renlund: Peptides from all sources/ ver. 3.1, 980610Synthetic PeptidesSynthetic PeptidesRPC method optimisation Make test runsat two pH valuespH 2.5Make gradient optimisation at both pH valuesScale up and purifyIdentification:MS, A A SequencePurity check: RP-HPLC, IEX, CZE pH 7.06Strategy/AC/1998/JB/. DanielssonProtein PurificationProtein PurificationAnalytical toolslA rapid and reliable assay for the target proteinlPurity determination(e.g. SDS-PAGE)lTo