提取RNA常见问题

1、提取RNA原理及其常遇到的问题RNA提取一般步骤总结-E/ a% A-RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于 RNA酶无处不在，随时可能将 RNA降解，所以实验中有很多地方 需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。-M: d9 I3 8RNA提取的一般步骤4 e$ s" p+ 6 16 m* b所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核 蛋白复合体变性；对内源 RNA酶的有效抑制；有效地将 RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但

2、其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：提取总核酸，再用氯化锂将 RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下 DNA和蛋白质进入有机相而 RNA留在水相。第一种提取方法将 导致小分子量 RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。实验步骤：?1 i1 U& A% N% A!z破碎组织一分离 RNA一沉淀 RNA-洗涤 RNAf融解 RNAf保存 RNA。1、 破碎组织和灭活 RNA酶可以同步进行，可以用盐酸月瓜、硫鼠酸月瓜、NP-40、SDS蛋白酶K等破碎组织，加入 3 -ME可以抑制RNA酶活性。.|# j$ w) s- q5 r52、分离RNA一般用

3、酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心， RNA一般 分布于上层，和蛋白层分开。8 12 T) a" |" L. a# n3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc (pH-5.2)或异丙醇。4、洗涤RNA使用70%乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。5、融解RNA 一般使用TE。6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量 RNase的污染，从富含RNase的样品(如胰脏、 肝脏)中分离到的 RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的 RNA,在水

4、中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的 RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量 RNase的降解比小转录 本更敏感。为了增加贮存 RNA样品的稳定性，可以将 RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于 -70C。用于保存 RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M , 12,000 Xg离心5分钟。 氯化锂法提取总 RNA:本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀 RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简

5、洁的长处，但也存在少量 DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片断丢失的缺陷。试验试剂：1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,过滤灭菌】：_* I/t M+ w8 a# - K' N+ c/ a3 C2、悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS% c5 L+ z& ?2 b! y3 z+ t试验步骤：1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞(107个细胞/ml),则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂尿素溶

6、液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。2 丫 x: p+ S& t" S- A'2、 匀桨液在0 4C放置4小时后，12000g离心30分钟。 L0 O. B7 K' x; g- N& - R3、取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂尿素溶液，重复步骤2。- k# S& m' j3 ) ?3 q( q4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置1530分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。5、取上层水相，力口 1/10倍体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙醇，20c放置1 小

7、时，5000g离心。6、 70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7、 RNA溶解液溶解沉淀，得 RNA,分装，于70c保存。 植物RNA提取过程中难点的相 应对策! e-酚类化合物的干扰及对策：$ h6 Y2 j0 c* D- k l许多植物组织特别是植物的果实(如苹果、樱桃、李子、葡萄等)和树木类植物中富含酚 类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料 匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应(browning effec

8、t)。被氧化的酚类化合物(如醍类)能和 RNA稳定 地结合，从而影响 RNA的分离纯化。但 Newbury等发现RNA提取的难易程度和材料中酚类 物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合糅质”即聚合多羟基黄酮醇类物质(如原花色素类物质)是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其和 RNA 分开。6 g1 R7 c） （ f& U（ k% X防止酚类化合物被氧化的方法：1、还原剂法：一般在提取缓冲液中加入（-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提

9、取液中（-疏基乙醇的浓度可高达 2%。（-疏基乙醇等还可以打断多 酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀 RNA时加入（-疏基乙醇（终浓度1 %）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醍的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醍类化合物可被还原成多酚化合物。2、螯合剂法：螯合剂聚乙烯口比咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚毗咯烷酮（PVPP）中的CO N =基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以和PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚

10、氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在 pH8.0以上时PVP结合多 酚的能力会迅速降低11。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要和其它方法结合使用。3、 Tris刷酸法：如果提取缓冲液中含有 Tris硼酸（pH7.5）,其中的硼酸可以和酚类化合物 依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其和RNA的结合。这一方法十分有效，所以L6 pez-G6 mez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris测酸浓度过高（ 0.2M）则会影响RNA的回收率。9 O W（ V+ A'

11、P* Y e: - E9 O' B2 F$ M4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质和 BSA间可产生类似于抗原一抗体间的相互 作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质和RNA结合的机会，因此提高了 RNA的产量。BSA和PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有 RNase,因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。.g2 D# o& D |; Z） z0 S; A/ A5、丙酮法：Schneiderbauer等用-70C的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料， 可以有效地从云 杉、松树、山毛棒等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA= %

12、 i2 v1 Y4 _; T/ f酚类化合物的去除 ：通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。和PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50%）来沉淀RNA,而多酚溶解于2-丁氧乙醇 中而被除去。然后用含50% 2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。多糖的干扰及对策：多糖的污染是提取植物 RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖， 而多糖的许多

13、理化性质和RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成 RNA产量的减少；而在沉淀 RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有 多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性， 因此污染了多糖的 RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸月瓜处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过 LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过 这些步骤仍会发现有相当多的多糖和RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化

14、时多糖污染的问题。l$ B1 U' j用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度 10%30%,可以使多糖沉淀下来，而 RNA仍保留于溶液中。一般都 是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取 RNA时， 在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度 10%以沉淀多糖。但 Tesniere等在从葡萄浆果组织中提 取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的 RNA溶液中加入终浓度 30%乙醇来沉淀多 糖的，进一步纯化了 RNA样品。-h3 6 W3 ） R& L8 F另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多

15、糖法。Bahloul等在提取云杉组织的 RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖； Ainsworth在提取酸模植物花组 织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉 的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提 取某些植物材料的 RNA时，是将上述两种方法结合使用。如 L6 pez-G6 mez等在提取芒果 中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入 0.25体积的无水乙醇和 0.11体积的5M醋酸钾溶液以 去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都

16、无效，只有两者结合 使用效果最佳。 & X1 r4 _（ _1 B. BFang等认为缓冲液中含有高浓度的 NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树 RNA时， 缓冲?中NaCl的浓度为2.0M和1.0M ,通过氯仿抽提和乙醇沉淀 RNA将RNA和多糖分离。 Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM ,然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。蛋白杂质的影响及对策：蛋白质是污染 RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下

17、研磨植物材料以抑制 RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、月瓜、SDS 十六烷基三甲基澳化俊（CTAB等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是 利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。Wilcockson利用蛋白质和RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70%高氯酸钠溶?中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于 70%高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。+ N9 a+ 2 R8 R- Q6 )次级

18、代谢产物的影响及对策：从植物组织中提取高质量 RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生 某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易和RNA结合并和RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化葩梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的 RNA。+ V" j- f Z& " E由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组

19、织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。7 b# V* i! z$ 5 E随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基石的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。植物

20、RNA提取中的一些特殊方法1d多酚类植物的RNA提取：苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。这个方法是验证过有效的，提取的RNA纯度不是特别高，但是用作northern足够。-I# h8 c& N9 i! ?(实验试剂：提取 buffer 200ml： NaCl 1.1688g 100mM Tris 2.4228g 10mM (tris-HCl 8.0)EDTA5.8450g10mM SDS 2.0000g 1% NaOH 调至 8.0，定至 200ml,加 200ulDEPC融解.试验步骤：1、1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品，立即加入500ul酚氯

21、仿，再加入500ul提取buffer, 剧烈振荡1-2min,冰上放置5min。v8 C# N r9 " F7 丫2、4度12000rpm离心15min,上清转入新管，加氯仿异戊醇抽提一次。$ I/ G( ?" p2 d6 L% Q;3、 取 600ul 异丙醇,-20 度沉淀 20min. s# A6 S- A3 i( d( b( t8 w4、 12000rpm 离心 10min。! y& X+ _3 f"j; k8 N/5、 沉淀用70度乙醇洗。6、 8000rpm 5min 。;J'_* J. U6 Cl'- R）7、沉淀晾干，溶于

22、30ulDEPC水。+ e2 , D5 n2 M* j0 X& r银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：5 c6 d & t） 银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏 RNA,而Shujun Chang等（1993）的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤 进行改进，得到质量较高的银杏 RNA样品。，X7 U7 B5 yl m9 R, G:试验试剂：1 k

23、6 c- A1 u1 l& h5 R21、 1M tris:1 2.11g T ris ,溶于60m L水中，用浓盐酸调至 Ph8 .0,定容至lOO mL.用灭菌的 DEPC水溶解。1 v9 Y8 N2 : z3 Q. A& x2 N4 r2、 500m M EDTA:1 8.61g E DTA "H 2O力口入 80m L 水中，搅拌溶解，用 NaOH 调 pH 至 8.0, 定容至 100mL。 3、 10 mollLLiCL: 42.4 gLiCL, 100mL 水溶解即可。4、提取缓冲液（DEPC水处理）:2% CTAB（蛋白质变性剂）.2% PVPK 30（去除多酚类物质）10 0m M Tris-HCL （Ph8.0）2