Chapter9电泳

1、 第九章 电泳和电色谱 (1)(1)电泳电泳( (Electrophoresis)Electrophoresis) 荷电溶质荷电溶质( (电解质电解质) )或粒子在或粒子在电场电场作用下发生作用下发生定向定向泳动泳动的现象，的现象，简称简称EPEP 。 (2)(2)电泳分离电泳分离 利用荷电溶质利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别在电场中泳动速度的差别进行分离进行分离的方法。的方法。带电粒子在电场作带电粒子在电场作用下向着与其电性用下向着与其电性相反的电极移动相反的电极移动(3)(3)电泳与色谱技术的比较电泳与色谱技术的比较 共同点：表象上均为溶质移动速度差异而分离共同点：表象上均为溶质移动速度

2、差异而分离不同点：产生溶质移动速度差的原理不同。不同点：产生溶质移动速度差的原理不同。色谱为浓差驱动的传质色谱为浓差驱动的传质平衡分离法平衡分离法电泳是外力电泳是外力( (电场力）作用下的电场力）作用下的差速分离法差速分离法 电泳色谱电泳色谱:将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合的技将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合的技术术 电色谱：电色谱：利用利用电渗作用电渗作用驱动流动相流动，依据溶质在固定驱动流动相流动，依据溶质在固定相和流动相的分配行为差异进行分离相和流动相的分配行为差异进行分离 一般情况下，二者并无严格区别，均称为电色谱一般情况下，二者并无严格区别，均称为电色谱(5)(5)电泳法的

3、发展电泳法的发展2020世纪初期世纪初期 已用于蛋白质的分离已用于蛋白质的分离 7070年代前，主要应用于分析目的年代前，主要应用于分析目的7070年代后，分离制备规模年代后，分离制备规模9090年代后，毛细管电泳和电色谱用于高速分析和年代后，毛细管电泳和电色谱用于高速分析和微量分离制备微量分离制备(6)(6)电泳法的特点电泳法的特点： （1 1）分辩率高）分辩率高, ,属高度纯化技术属高度纯化技术 （2 2）电场作用）电场作用 （3 3）设备放大难，多用于分析（实验室应用）设备放大难，多用于分析（实验室应用）(7)(7)电泳技术的分类电泳技术的分类 根据原理和操作形式可分为根据原理和操作形式

4、可分为： 区带电泳区带电泳 等电点电泳等电点电泳 等速电泳等速电泳 根据是否使用凝胶载体可分为根据是否使用凝胶载体可分为： 凝胶电泳凝胶电泳( (Gel electrophoresisGel electrophoresis) ) 自由流电泳自由流电泳( (FreeflowFreeflow electrophoresis electrophoresis) 以琼脂糖、淀粉胶及聚丙以琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的烯酰胺等物质作支持体的电泳电泳。无固相支持介质无固相支持介质, ,用特定缓冲液作为用特定缓冲液作为分离介质分离介质的电泳分离纯化技术的电泳分离纯化技术 按支持物的装置形式不同，区

5、带电泳可分为按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为: : (1)(1)板式电泳板式电泳： 水平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方水平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。式。 垂直板式电泳：支持物垂直放置垂直板式电泳：支持物垂直放置 (2)(2)柱式电泳：柱式电泳：采用圆柱形凝胶柱，电泳分离后可将凝胶切片，回收组采用圆柱形凝胶柱，电泳分离后可将凝胶切片，回收组份，多用于制备份，多用于制备 (8)(8)电泳的应用电泳的应用： 1 1、分离各种生物产物：如蛋白质、酶、核酸等、分离各种生物产物：如蛋白质、酶、核酸等 2 2、分析某种物质的纯度及分子量、分析某种物质的纯度及分子量e6e

6、ZEvr 061eZf krurkr 一、自由溶液中的电泳速度一、自由溶液中的电泳速度U0为迁移率迁移率(mobility)：单位电场强度下带电粒子的泳动速度：单位电场强度下带电粒子的泳动速度当当f=f时时，荷电溶质恒速泳动，则，荷电溶质恒速泳动，则静电引力静电引力 f=EZe黏性阻力黏性阻力 f=6e或e=u0EU0=eZ/6r kr为粒子半径与双电层厚度的比值为粒子半径与双电层厚度的比值Z溶质电荷数溶质电荷数E-电场强度电场强度电子电量电子电量r球形溶质半径球形溶质半径,溶液粘度溶液粘度 Ve溶质运动速度溶质运动速度二、凝胶中的电泳速度二、凝胶中的电泳速度 凝胶电泳的优点凝胶电泳的优点 可

7、避免或减小因对流或热扩散引起的分离度降低可避免或减小因对流或热扩散引起的分离度降低( (较自由流较自由流电泳分离度高）；凝胶本身具有分子筛的作用，有利于提电泳分离度高）；凝胶本身具有分子筛的作用，有利于提高电泳分离度。高电泳分离度。 凝胶电泳的缺点凝胶电泳的缺点 凝胶载体对溶质泳动产生的阻力凝胶载体对溶质泳动产生的阻力影响电泳速度影响电泳速度，并且，并且耗电耗电量大，处理量较小量大，处理量较小 常用的常用的凝胶载体凝胶载体 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖、淀粉（琼脂糖、淀粉（易发生易发生电渗流电渗流，造成分离度下降，造成分离度下降） 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳速度凝胶电泳速度Lgu=l

8、gu0-KrTgUo为自由溶液中的迁移率为自由溶液中的迁移率Kr为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数Tg 为凝胶浓度为凝胶浓度由丙烯酰胺单体和交由丙烯酰胺单体和交联剂联剂N,N-N,N-亚甲基双亚甲基双丙烯酰胺共聚而成丙烯酰胺共聚而成三、电渗流速度三、电渗流速度电渗流的概念电渗流的概念琼脂糖等凝胶载体在电场作用下琼脂糖等凝胶载体在电场作用下易电离带负电荷易电离带负电荷，其诱，其诱导的导的双电层中反离子在电场作用下发生定向泳动双电层中反离子在电场作用下发生定向泳动（向阴（向阴极移动），并带动周围的溶剂（水）化层一起泳动，并极移动），并带动周围的溶剂（水）化层一起泳动，

9、并在摩擦力作用下，在摩擦力作用下，带动主体溶液一起移动带动主体溶液一起移动的现象的现象电渗流造成凝胶电泳分离度降低电渗流造成凝胶电泳分离度降低电渗流驱动的电色谱的流速电渗流驱动的电色谱的流速 流速流速与操作压力无关与操作压力无关，即电渗流不会引起色谱柱压力的增，即电渗流不会引起色谱柱压力的增大大 电渗流速度电渗流速度与固定相粒径无关与固定相粒径无关，电色谱可采用比，电色谱可采用比HPLC更更小的固定相粒子（小的固定相粒子（1.5-5um)电渗流速度公式详见电渗流速度公式详见P366HPLC常采用固定相粒径常采用固定相粒径5um四四、影响电泳迁移速度的因素影响电泳迁移速度的因素(1)(1)样品性

10、质样品性质(2)(2)电场强度电场强度(3)(3)缓冲液的性质缓冲液的性质(4)(4)电渗电渗(5)(5)温度温度 (1) (1) 样品性质样品性质：带电量，分子大小，形状带电量，分子大小，形状 分子带电量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳分子带电量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快迁移速度越快 (2) (2) 电场强度电场强度：电场强度对电泳速度起着决定性作用，电电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强度越高，电泳速度越快场强度越高，电泳速度越快过高，产热，样品和过高，产热，样品和BufferBuffer扩散增加，条带增宽，蛋白变扩散增加，条带增宽，蛋白变性。性。过低

11、，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时（如高压电泳），需附有冷却装置电泳时间时（如高压电泳），需附有冷却装置 (3) (3) 缓冲液的性质缓冲液的性质 a a 缓冲液的缓冲液的pHpH pH pH 决定带电量，决定带电量，(pH-PI)(pH-PI)越大，带电量越多，迁移速率越越大，带电量越多，迁移速率越大大 b b 离子强度离子强度 I I越大，样品电流减小，迁移率变小；越大，样品电流减小，迁移率变小；I I越小，样品电流越越小，样品电流越大，迁移率越大，但样品易扩散，一般大，迁移率越大，但样品易扩散，一般I I在在0.02

12、-0.02-0.2M0.2M 选择合适的选择合适的pH，使各种蛋，使各种蛋白质所带电荷差异较大，白质所带电荷差异较大，利于彼此分开；电泳过程利于彼此分开；电泳过程中须采用具有一定缓冲能中须采用具有一定缓冲能力的缓冲液使力的缓冲液使pH值恒定值恒定 。 (4) (4) 电渗电渗 当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。（5 5）温度）温度 过高，由于产热增加、水分蒸发，对电泳不利。过高，由于产热增加、水分蒸发，对电泳不利。利用凝胶的利用凝胶的分子筛作用分

13、子筛作用使使分子大小不同分子大小不同的电解质得到分的电解质得到分离。离。相对分子质量大相对分子质量大的溶质的溶质受凝胶阻滞作用受凝胶阻滞作用大，泳动速度大，泳动速度较较慢慢，而，而小分子小分子溶质泳动溶质泳动速度较快速度较快。经过一定时间的电泳。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含数条含有不同溶质的区带有不同溶质的区带，实现溶质之间的相互分离。是，实现溶质之间的相互分离。是区带区带电泳分离法电泳分离法 凝胶电泳与凝胶过滤的区别凝胶电泳与凝胶过滤的区别： 凝胶电泳：凝胶电泳：样品中各分子的运动速度是小分子快于样品中各分子的运

14、动速度是小分子快于大分子大分子 凝胶过滤凝胶过滤：大分子运动快于小分子：大分子运动快于小分子原因原因：凝胶电泳中：凝胶电泳中,系统里没有空隙体积系统里没有空隙体积,只有网状骨只有网状骨架。大分子物质不及小分子物质容易移动。架。大分子物质不及小分子物质容易移动。 1.1.板式凝胶电泳板式凝胶电泳 处理量很小，不适合生物产物的分离制备。处理量很小，不适合生物产物的分离制备。 水平式平板凝胶电泳水平式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳凝胶电泳的类型凝胶电泳的类型 2.2.圆柱型凝胶柱圆柱型凝胶柱 凝胶切成圆片，分别溶出各个组分。凝胶切成圆片，分别溶出各个组分。 缺点：操作过于繁琐，回收

15、率不高，缺点：操作过于繁琐，回收率不高，且易变性且易变性优点：操作简便，凝胶可重复使用。优点：操作简便，凝胶可重复使用。缺点：回收的溶质浓度很低缺点：回收的溶质浓度很低。连续洗脱凝胶电泳：连续洗脱凝胶电泳：当溶质泳动当溶质泳动到凝胶末端时，通入洗脱液分别到凝胶末端时，通入洗脱液分别回收各个组分回收各个组分。根据溶质的相对分子质量选择根据溶质的相对分子质量选择 7.57.5的聚丙烯酰胺凝胶的聚丙烯酰胺凝胶孔径较小，适用于相对分子质量为孔径较小，适用于相对分子质量为10kD10kD1000kD1000kD的溶质的溶质的分级分离；的分级分离； 3.53.5的聚丙烯酰胺凝胶的聚丙烯酰胺凝胶孔径较大，适

16、用于相对分子质量为孔径较大，适用于相对分子质量为1000kD -5000kD1000kD -5000kD的溶的溶质的分级分离质的分级分离 聚丙烯酰胺与琼脂糖的混合凝胶，或纯琼脂糖凝聚丙烯酰胺与琼脂糖的混合凝胶，或纯琼脂糖凝胶胶孔径更大，适用于分离相对分子质量更大的溶质。孔径更大，适用于分离相对分子质量更大的溶质。核酸的分离通常采用核酸的分离通常采用0.50.5-1-1的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶凝胶种类和浓度凝胶种类和浓度电泳槽电泳槽制备胶板制备胶板放置样品梳放置样品梳加样加样电泳电泳观察和拍照观察和拍照凝胶电泳操作步骤凝胶电泳操作步骤制胶或染色时加入的制胶或染色时加入的染料染料EBEB是强诱变剂

17、是强诱变剂, ,具有高致癌性，配制具有高致癌性，配制和使用时都应戴手套和使用时都应戴手套实验结束后，应对含实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康弃置，以避免污染环境和危害人体健康 M 1 2 3 4PCR产物的产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳由浓度不同的两层凝胶组成由浓度不同的两层凝胶组成: :浓缩层和分离层浓缩层和分离层 上层凝胶：浓缩层上层凝胶：浓缩层凝胶浓度较低凝胶浓度较低( (丙烯酰胺浓度为丙烯酰胺浓度为2 23 3TgTg) )，孔径较大，孔径较大，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，溶质以溶质以等速

18、电泳等速电泳的形式泳的形式泳动，得到浓缩。动，得到浓缩。 下层凝胶：分离层下层凝胶：分离层凝胶浓度较高凝胶浓度较高(5(52525TgTg) )，各个组分根据，各个组分根据迁移率的差迁移率的差别别得到分离。得到分离。二、不连续凝胶电泳二、不连续凝胶电泳不连续凝胶电泳的分离原理： 1、样品的浓缩效应 1）凝胶层的不连续性 2）缓冲液离子成分的不连续性 2、电荷效应 各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率也不同 3、分子筛效应 凝胶浓度不同， 网孔径大小不同。 分子量和构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，引起泳动速度的变化，从而达到分离目的。 影响因素： 1、聚丙烯酰胺凝胶孔径的大

19、小 2、缓冲系统 3、离子强度 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。成。不连续电泳的三个不连续性：不连续电泳的三个不连续性：a.a.凝胶浓度的不连续性凝胶浓度的不连续性( (分离胶浓度分离胶浓度 浓缩胶）浓缩胶）b.b.缓冲液缓冲液pHpH值的不连续性值的不连续性 c.c.缓冲液离子成分的不连续性缓冲液离子成分的不连续性不连续电泳的不连续性不连续电泳的不连续性浓缩层凝胶缓冲液为浓缩层凝胶缓冲液为pH6.8的的Tris-HC1；分离层凝胶缓冲；分离层凝胶缓冲液为液为pH8.9的的Tris-HC1；电极；电极缓冲液是缓冲液是pH8.3 Tris-

20、甘氨酸甘氨酸-HC1缓冲液。缓冲液。蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素电泳中的分离因素电荷因素分子大小分子形状分子形状和大小相同，分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不所带电荷性质和数量不同同分子形状和所带电荷性质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不和数量相同，分子大小不同同分子所带电荷性质和数量分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同相同，分子形状不同SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙其

21、所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl(sodium dodecyl sulfate, sulfate,简称简称SDS)SDS)，则蛋白质分子的，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用状无关。因此可以利用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量。应用：应用：主要用于成分分析，在物质的分离回收方主要用于成分分析，在物质的分离回收方面应用极少。面应用极少。

22、缺点：缺点：每个区带互相连接，回收困难。每个区带互相连接，回收困难。 电泳装置的散热问题难于解决电泳装置的散热问题难于解决。分离操作及其特性（分离操作及其特性（p371)p371)1.1.分离操作分离操作以分离蛋白质为目的时，上部缓冲液根据待分离蛋白质以分离蛋白质为目的时，上部缓冲液根据待分离蛋白质的等电点的等电点(pI(pI) )选定。选定。2.2.分离特性分离特性 定义：一种利用具有定义：一种利用具有连续连续pHpH梯度梯度的支持介质分离的支持介质分离等点电不同的蛋白质等点电不同的蛋白质的电泳技术。的电泳技术。等等 电电 聚聚 焦焦 电电 泳泳一、一、 在电泳介质中放入在电泳介质中放入载体

23、两性电解质载体两性电解质，当通以直流电时，当通以直流电时，两性电解质即形成一个两性电解质即形成一个由正极到负极逐步增加的由正极到负极逐步增加的pHpH梯度梯度，正极附近是低正极附近是低pHpH区，负极附近是高区，负极附近是高pHpH区。区。 蛋白质（和氨基酸）等两性电解质具有等电点，在等电蛋白质（和氨基酸）等两性电解质具有等电点，在等电点的点的pHpH值下呈电中性，不发生泳动。因此，在此体系中，值下呈电中性，不发生泳动。因此，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相应的等电点位置上聚焦于其相应的等电点位置上，形成具有不同等电点的蛋白质区带形成具有不同等电点的蛋白质区带

24、pI1pI2pI3 pIn- -+ +蛋白质分子的等电聚焦过程蛋白质分子的等电聚焦过程进行进行IEFEIEFE必须具备必须具备3 3个条件个条件：有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的连续连续pHpH梯度梯度有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合不再重新混合电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带连续连续pHpH梯度的调配梯度的调配凝胶中加有凝胶中加有两性电解质两性电解质溶液（溶液（pH9-3） 加电场加电场后在凝胶内后在凝胶内形成一个稳形成一个稳定定pH梯度梯度 加样品

25、，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明凝胶染色表明样品按照各自样品按照各自pI值沿着值沿着pH梯度分布梯度分布等电聚焦示意图等电聚焦示意图（一）优点（一）优点1.1.分辨率高分辨率高 分辨率较不连续分辨率较不连续PAGEPAGE更高更高（精密度可达（精密度可达0.01pH0.01pH单位，灵敏度高，最低检出量达单位，灵敏度高，最低检出量达0.1ng0.1ng）。）。2.2.重复性好。重复性好。二、二、IEFEIEFE的特点的特点 可消除分子扩散引起的分离度下降，可消除分子扩散引起的分离度下降，电泳区带相当狭窄。特别适合于电泳区带相当狭窄。特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生分离分子量

26、相同而电荷不同的生物大分子。物大分子。（二）缺点（二）缺点 1.1.载体两性电解质污染产品载体两性电解质污染产品 2.pH2.pH梯度的稳定性不高梯度的稳定性不高 3.3.操作过程中易发生凝胶起皱脱水现象操作过程中易发生凝胶起皱脱水现象 4.4.样品中的成分必须停留在其样品中的成分必须停留在其pIpI，不适用在，不适用在pIpI不溶或发生不溶或发生变性的蛋白质。变性的蛋白质。第四节第四节 二维电泳二维电泳 Two-dimensional electrophoresis一、定义一、定义 同时利用分子的大小和等电点这两种性质的差同时利用分子的大小和等电点这两种性质的差别进行蛋白质等生物大分子的分离

27、，即将别进行蛋白质等生物大分子的分离，即将普通普通凝胶电泳和凝胶电泳和IEFIEF相结合相结合，因此分离效率更高，因此分离效率更高。原理：原理：在凝胶电泳槽的在凝胶电泳槽的y y方向上凝胶具有浓方向上凝胶具有浓度分布度分布( (逐渐增大逐渐增大) )，而在，而在x x方向上具方向上具有有pHpH梯度梯度（1 1）首先在）首先在x x方向上调配方向上调配pHpH梯度，梯度，使溶质分子以等电点聚焦的形式泳使溶质分子以等电点聚焦的形式泳动到其等电点处。动到其等电点处。（2 2）将适当）将适当pHpH值的缓冲液渗透到凝值的缓冲液渗透到凝胶中胶中( (以取代形成以取代形成pHpH梯度的载体两性梯度的载体

28、两性电解质电解质) )，在，在y y方向上加电场使溶质方向上加电场使溶质再次泳动。此时溶质之间的泳动速再次泳动。此时溶质之间的泳动速度受荷电量及相对分子质量的影响，度受荷电量及相对分子质量的影响，直至泳动到被高浓度凝胶所阻滞，直至泳动到被高浓度凝胶所阻滞，相互之间得到进一步的分离。电泳相互之间得到进一步的分离。电泳结束后将凝胶切成小块，分别回收结束后将凝胶切成小块，分别回收各个组分。各个组分。y 二维电泳的特点二维电泳的特点：优点：可分离等电点差小于优点：可分离等电点差小于0.010.01个个pHpH单位的蛋白单位的蛋白质，分离度极高。质，分离度极高。 缺点：与普通缺点：与普通IEFIEF一样，处理量很小，适用于分离一样，处理量很小，适用于分离微量的高纯度目标产物，多用于分析。微量的高纯度目标产物，多用于分析。 第五节第五节 逆向作用色谱电泳逆向作用色谱电泳 CACE(Counteracting chromatographic electrophoresis) CACE CACE的分离原理的分离原理略利用层析速度的梯度变化实现溶质在电场中的聚焦