原核表达的详细步骤

1、原核表达详细步骤Part选择表达的目的基因一、 基因序列 1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:    利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。    实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。    利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。 2. 注意事项： 区别ORF和CDSORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定

2、义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、”，partial CDS的读码是相应的AA 在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。 二、 抗原决定簇的预测 1、        原理： 蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由612 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了

3、产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。 2、        选择原则： （1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。 （2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。 （3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的

4、抗原决定簇区域。 3、选定抗原决定簇的步骤： （1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。在线网站预测（/molbio/hla_bind/index.shtml and   http:/www.imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html  ） （2）选定：接近N、C端；选取在此区间内，（Antigenic Index）Jameson-wolf抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicity plot）Kyte-Doolit

5、tle预测亲水性强的区域。同时符合以上3点的区域较好（命名为多肽片断A）。 注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽所在的区域 （3）NCBI（BlastP）比对：将多肽片断A放入blastp进行同源性比对。如果制备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性。 注：这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！ （4）抗原合成： 原核表达： 化学合成：需要做化学偶联增强多肽稳定性。多肽的纯度越纯越好，一般> 80%就完全可以了。合成5-10 mg就可以了。 Part选择表达系统一、 选择表达载体 1、选择表达载体的原则 （

6、1）蛋白质大小：决定在胞质中表达还是以包涵体的形式表达，是否加标签或以融合蛋白的形式表达。 （2）蛋白需求量：根据实验方案确定蛋白需求量，选择合适的载体。 （3）蛋白质是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表达（胞质蛋白），无活性的不溶的蛋白（包涵体蛋白） 2、原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列：用于筛选重组子，有抗生素抗性基因 、报告基因（GFP等） （2）可控转录的启动子： 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。启动子的强弱是对表达量有决定影响的因素之一。没有启动子，基因就不能转

7、录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游510 bp处，有一段由68个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合

8、酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （3）转录终止子： 在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释

9、放出来。对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构。这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应的一串U。转录终止的机制较为复杂，并且结论尚不统一。但在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。 （4）核糖体结合位点（SD序列）： 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游310 bp处的由39

10、bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。 （5）多克隆位点（MCS）：选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建重组子进行酶切时会把靶基因给切开。在惠赠或交换的质粒中确定MCS的正确性，否

11、则会造成错读密码子。 （6）复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子（复制起始部位）的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元（？）是否相容的问题。 （7）融合Tag：基因融合是将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接起来，并且正确读码。在表达靶蛋白是加上融合标签的好处，（a保护靶蛋白免受原核宿主蛋白酶的降解；b提供亲和纯化的配基结合位点；c改善靶蛋白的溶解性，使其

12、正确折叠；d与已知酶或抗原结构域连接，可以进行标记和分离；e与信号肽连接，可将融合蛋白分泌到特定细胞区域。） 注：选择融合蛋白表达载体时，融合标签与靶蛋白的连接处如果有酶切位点，且想除去标签，则载体的酶切序列在靶蛋白中不能出现。 二、 选择表达宿主 首先要看靶基因中有没有细菌不常用的密码子如果有，需要考虑换表达菌株。每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以

13、换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。以Novagen为例，如果使用BL21(DE3)表达不成功的话可以换Rosetta系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET 相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA 的tRNA。所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密码子造成的。另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。 1.    原核表达系统（大肠杆菌） 优点：遗传图谱明确容易培养且费用低对许多外源蛋白耐受能力强能高水平表达这些蛋白 缺点：蛋白质

14、不能进行翻译后修饰（在真核高尔基复合体中的糖基化修饰，特点位点的切割等产生具有活性的蛋白）具有密码子的偏好（？） 2.    真核表达系统   优点：可以产生修饰的蛋白 缺点：真核表达系统复杂费用高 注：不同的表达宿主有相应的表达载体，二者应是最佳表达组合。 Part构建重组子一、 重组子的构建 1. 设计引物：a保证引物序列扩出的靶基因插入到表达载体MCS上，能够正确读码；b引物两端加入酶切位点；c遵循引物设计原则（一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件）。

15、2.     扩增靶基因： （1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环 获得所需基因片段。 （2）通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行 PCR循环获得产物。 注：但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。尤其注意不要引入终止 密码子。 3.     限制性内切核酸酶消化载体DNA

16、 和目的基因： （1）载体双酶切后回收：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。（减少假阳性的重组质粒连接，去除切下的小片段多克隆位点） （2）PCR产物双酶切后回收：限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。    注：双酶切后，进行回收纯化，可以提高阳性克隆的几率。 4. 连接目的基因和载体 二、 重组子的验证 1. 将连接产物转化到相应的宿主菌（感受肽的制备，转化） 2. 鉴定带有重组质粒克

17、隆：常用方法的有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、PCR以及杂交筛选。如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落（甚至全部为重组子）。 3. 筛选出含重组子的转化菌落，DNA 序列测定。（正确测序） 测序结果出来后，首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号，读码是否正确，这是最有说服力的鉴定结果。有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端相同的不同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特别是用到XbaI之类的酶要小心。 然后要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。 注：长期保存的重组

18、子在高浓度甘油（19）中会导致质粒不稳定，即脱质粒。可以将载体和宿主分别保存。 Part诱导表达一、 诱导表达 1.     诱导表达类型 组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。 诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降

19、解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。 融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。 分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分

20、泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。 可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包涵体容易纯化但是复性效率不高（非常股复杂）。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。 2.诱导表达 （1）挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50g/ml）中37过夜培养。 （2）按150比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的培养瓶中, 37震荡培养至OD6000.4-1.0（最好0.6，大约需3h。 （3）取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入100mMIPTG至终浓度为0

21、.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac启动子），作为实验组,两组继续 37震荡培养3h。 （4）分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用PBS重悬、洗涤、离心。 （5）对细菌沉淀进行处理，做SDS-PAGE等分析。 3.注意事项： （1）关于表达不出来的原因有很多 a如果测序都是正确的话，设计一个postive expression control，验证整个表达系统没问题。 b检测是否有毒性。涂一个IPTG的板子看菌落生长情况如何。 c 看看稀有密码子情况，是不是存在成簇的N端的稀有密码子。 d看看稳定性，上swiss prot看看在大肠杆菌中的稳定时间是多少。

22、 e如果表达的是真核蛋白，可能问题更复杂，可能涉及到伴侣蛋白等问题？ f 有人会检测mRNA的稳定性。 g可以用亲和层析等办法富集你的目的蛋白，然后再跑胶。因为有时你的目的蛋白表达丰度过低，SDS-PAGE检测不到。 （1）提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。 （2）IPTG：IPTG浓度0.2-0.5mM IPTG足够了，不会降低表达量，反而会增加蛋白的可溶性。IPTG浓度过高，易使蛋白表达速度增大，来不及正确折叠而产生不溶性蛋白（包涵体）。T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度（25uM-1mM之间）

23、使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。 （3）温度：一般37诱导3-4小时，30诱导6小时是蛋白表达的最大产量期。22、18、16等低温诱导时间在12h-48h。低温诱导可使蛋白缓慢合成，利于蛋白正确折叠形成可溶性蛋白。为了得到更多的可溶性蛋白，可以考虑将温度再降（但表达总量会有所降低），可以考虑25°，诱导8-10个小时；20°诱导14-18个小时；甚至15°24-36小时诱导。 二、 检测诱导表达 1.细菌的裂解裂 常用方法有：高温珠磨法；高压匀浆；超声破碎法；酶溶法；化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法、已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应

24、用较为广泛。 下面介绍酶溶法和超声破碎法结合使用的实验步骤。 （1）常用的溶解酶有溶菌酶；-1,3 -葡聚糖酶；-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。4 ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（30 mL ）。弃上清，1mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀，30作用1h。 （2）超声破碎细菌，40w,10s,10s,50次；12000rpm ,4 离心，15min ，分别收集上清液和沉淀。分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，待检测。 注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞

25、浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。 2进行SDS PAGE检测 （1）表达结果： a细胞质中表达；b包涵体形式表达。 （2）包涵体的纯化 a包涵体的洗涤；b包涵体的溶解；c包涵体的检测 从基因角度改造一下，如果能够去掉一些疏水区段会很大程度上改善蛋白的可溶性 （4）注意事项 a所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性； b根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。具体的序列和说明 都可以从中下载。 c包涵体蛋白溶液保存在四度里，避免反复冻融，否则体系不稳定，蛋白

26、以沉淀析出；胞质蛋白不能在四度放置很久，因为上清中含有很多蛋白酶，会把靶蛋白降解掉。 1. 了解实验课题对目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即标签的存在是否会影响蛋白的活性）。还要对目的蛋白进行稀有密码子（仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考，注意稀有密码子的多少，位置5位或3位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测等。稀有密码子预测网址：

27、.ru/eng/scripts/01_11.html/mmaduro/codonusage/usage.htm/RACC//sumchan/caltor.html原核表达蛋白可溶性预测网址：/综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌。注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。一般我们最常用的是

28、胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。2. 搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N端还是在C端，若要在C端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列，则引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游引物处引入His的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变；1，2步的分析至关重要，只有在完成前

29、两步的工作后才可以进行后续的实验操作。3. 摇菌，进行RNA抽提（注意选取不同表现型的菌株），摇菌的时间一定不要太长，太长的话RNA活性不高；4. mRNA反转成cDNA（此步应在第三步完成后立即操作，RNA存放时间长易降解）；5. 以cDNA为模板，利于设计好的引物进行PCR扩增；6. 通过胶回收试剂盒回收目的DNA片段。真核基因组DNA的克隆cDNA的克隆化技术的成熟，很多染色体的mRNA互补的序列已弄清楚，为丰富人体遗传信息库做出了贡献。除此以外，真核细胞染色体DNA消化后的片段，合适的载体进行克隆，也是得到目的基因的重要方法。染色体DNA序列大部分含有插入序列，即内含子（intron)

30、内含子的数量不等。而cDNA则仅代表了外显子(exon）的序列。大肠杆菌等原核细胞不能识别真核细胞染色体DNA的内含子，因此其表达研究，仅可应用cDNA，而不能应用真核基因组带有内含子的DNA，基因治疗中的目的基因，既可选择。DNA，也可选择染色体DNA。一、染色体DNA克隆的载体构建染色体DNA文库并进行克隆的载体有两大类：入噬菌体载体和粘粒载体。质粒载体其容量有限，而染色体DNA由于带有内含子序列而较长；单链丝状噬菌体载体仅用于克隆单链DNA,因此质粒载体和单链丝状噬菌体载体都不适用干染色体DNA的克隆。由于粘粒可接纳近45kb的外源DNA，几乎是入噬菌体载体载量的2倍，因此，在一个哺乳动

31、物基因组DNA文库中，仅需350000个重组枯粒，则可望某一特定的单拷贝序列存在于其中的概率达99。然而，在粘粒中构建和贮存文库要比在入噬菌体中更困难得多，因而只有当靶基因过大，而不能为单个入噬菌体所包容，或者要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时，才采用粘粒。染色体DNA克隆最为常用的载体还是入噬菌体载体。以入噬菌体为基础构建的载体尽管已是分离众多真核cDNA及基因组DNA的有力工具，但它们也只能接纳大小在一定范围内的插入片段。许多基因由于过于庞大，而不能作为单一片段克隆于这些载体之中，如人凝血因子讯基因长达180kb，肌营养不良基因至少长1800kb，因此需要建立容量更大的克隆载体。酵母人工染色体（YAC）方法的建立，使克隆DNA大区段的工作至少有了可循之经。使用YAC载体进行克隆时，基因组DNA须在剪切力较小的条件下从实验组织中小心制备，以便得到平均数百万碱基对大小的片段。随后应用一限制酶（如EcoRD部分消化DNA，以产生平均大小为20。一500kb的大片段这些片段再连接到经过适当处理以防止自身环化的YAC载体两臂上。除EooRI以外，也可用Notl和Mlul一类切点稀