实验五(一)、培养基的制备与灭菌

1、（一）培养基的制备与灭菌（一）培养基的制备与灭菌实验五、土壤中微生物的分离纯化实验五、土壤中微生物的分离纯化与活菌计数与活菌计数一、培养基的制备一、培养基的制备目的要求目的要求明确培养基的配制原理明确培养基的配制原理通过对基础培养基的配制，掌握配制培通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤养基的一般方法和步骤按培养基的用途分按培养基的用途分基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基选择培养基选择培养基按培养基的物理状态分按培养基的物理状态分固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基液体培养基液体培养基基本原理基本原理按成分不同分按成分不同分天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基

2、半合成培养基半合成培养基培养基的配方培养基的配方牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨琼脂培养胨琼脂培养基（一种天基（一种天然培养基，然培养基，用于分离和用于分离和培养细菌）培养细菌） 配方：配方：牛肉膏牛肉膏 3g蛋白胨蛋白胨 10g氯化钠氯化钠 5g琼脂琼脂 20g水水 1000mlpH 7-7.2灭菌灭菌 121 20min 高氏高氏号培养号培养基（一种合成基（一种合成培养基，可用培养基，可用于培养放线菌）于培养放线菌） 配方：配方：可溶性淀粉可溶性淀粉 20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g琼脂琼脂 20g水水 1000mlpH 7.27

3、.4灭菌灭菌 121 20min 马丁氏培养基马丁氏培养基（一种合成培（一种合成培养基，可用于养基，可用于分离培养真菌）分离培养真菌） 配方：配方：蛋白胨蛋白胨 g葡萄糖葡萄糖 10gK2HPO4 gMgSO4 7H2O 0.5g琼脂琼脂 20g%孟加拉红水溶液孟加拉红水溶液 3.3ml水水 1000mlpH 自然自然灭菌灭菌 121 30min 使用前，添加链霉素使用前，添加链霉素 固体淀粉培养固体淀粉培养基（一种鉴别基（一种鉴别培养基，用于培养基，用于大分子物质水大分子物质水解的生理生化解的生理生化鉴定）鉴定）配方：配方： 蛋白胨蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏牛肉膏 5g 可溶性淀

4、粉可溶性淀粉 2g 蒸馏水蒸馏水 1000ml 琼脂琼脂 20g 灭菌灭菌 121 20min葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水培养基（一水培养基（一种鉴别培养基，种鉴别培养基，用于肠道菌的用于肠道菌的生理生化鉴定）生理生化鉴定） 配方：配方： 蛋白胨蛋白胨 5g 葡萄糖葡萄糖 5g K2HPO4 2g 蒸馏水蒸馏水 1000ml pH 7.07.2 灭菌灭菌 112 30min 器材器材溶液或试剂溶液或试剂 4mol/L NaOH，1mol/L HCl，各类培养基的配方药品。，各类培养基的配方药品。仪器或其他用具仪器或其他用具 试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，试管，三角瓶，搪瓷杯，量

5、筒，天平，药匙，电磁炉，高压蒸气灭菌锅，高压蒸气灭菌锅，pHpH试纸试纸(pH5.5(pH5.59.0)9.0)，硅胶塞，棉，硅胶塞，棉花，报纸，记号笔等。花，报纸，记号笔等。 操作步骤（一）操作步骤（一）1 1 计算 ：根据配方按照用量计算。2. 2. 称量：3 3溶解：如有琼脂，要不断搅拌避免糊底。4 4、调节pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节，以pH试纸或pH计测定。5 5过滤：趁热用四层纱布过滤。（本次实验省略） 操作步骤（二）操作步骤（二）6.分装 试管：固体不超过试管高度的 1/5；液体、半固体不超过试管高度的1/4或1/3 。三角烧瓶：总体积的一半为限。管口

6、或瓶口不得沾有培养基操作步骤（三）操作步骤（三）7.加塞1.正确；正确；2.管内部分太短，外部太松；管内部分太短，外部太松；3.外部过小外部过小操作步骤（三）操作步骤（三）8.包扎：注明培养基的名称。9.灭菌 ：按不同培养基所需的温度、时间灭菌。10.搁置斜面 (1/3l/2，不能超过，不能超过1/2)。11.无菌检查实验无菌器皿的准备实验无菌器皿的准备无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水，无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水， 经经121 20min121 20min灭菌。灭菌。无菌无菌移液吸管移液吸管、培养皿培养皿：报纸包扎后，经：报纸包扎后，经121 20min121 2

7、0min灭菌灭菌 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 目的要求目的要求二、消毒与灭菌 灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。过滤、照射和使用化学药品等方法。 基本原理基本原理干热灭菌干热灭菌火焰灼烧法火焰灼烧法干热灭菌法干热

8、灭菌法（烘箱内热空气灭菌法）（烘箱内热空气灭菌法）湿热灭菌法湿热灭菌法加压蒸汽灭菌法加压蒸汽灭菌法紫外线灭菌法紫外线灭菌法微孔滤膜过滤除菌微孔滤膜过滤除菌火焰灼烧法火焰灼烧法直接在火焰上灼烧灭菌直接在火焰上灼烧灭菌主要用于实验室接种针主要用于实验室接种针( (环环) )、试管口、三角瓶口、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。和金属小工具等的灭菌。干热灭菌法干热灭菌法设备：电热烘箱设备：电热烘箱适用于适用于耐高温器皿耐高温器皿，160-170160-170，维持，维持2 2小时小时注意事项：注意事项：温度不可超过温度不可超过180180，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸，以防玻璃器皿上的棉塞及包装

9、纸烤焦着火。烤焦着火。灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。起火。电烘箱内温度电烘箱内温度7070时，方可打开箱门，以免骤然降温时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。导致玻璃器皿炸裂。2.湿热灭菌(一）高压蒸汽灭菌法 ：是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa0.1MPa，121121保持保持151530min30min进行灭菌，从而导致进行灭菌，从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长菌体蛋白

10、质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。 卵白蛋白含水量卵白蛋白含水量/%/%3030分钟内

11、凝固所需温度分钟内凝固所需温度/505625748018809061450160170蛋白质含水量与凝固所需温度的关系蛋白质含水量与凝固所需温度的关系为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？原因二：湿热的穿透力比干热大。原因二：湿热的穿透力比干热大。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。温度温度/时间时间/h透过布层的温度透过布层的温度/灭菌灭菌干热干热1301404867270.5不完全不完全湿热湿热105.33101101101完全完全在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度低在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度

12、低于饱和蒸汽的温度，所以于饱和蒸汽的温度，所以排气排气是否完全很重要。是否完全很重要。间歇灭菌法： 应用于不易于高压蒸汽灭菌的培应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，每天加热每天加热10030min10030min、连续三天，可彻底灭菌。、连续三天，可彻底灭菌。煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒时间为毒法。一般煮沸消毒时间为101015min15min。超高温杀菌： 此法指在温度和时间标准分

13、别为此法指在温度和时间标准分别为135135150150和和2 28s8s的条件下对牛乳或其他液态的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺。食品进行处理的一种工艺。2.湿热灭菌(二）l高压蒸汽灭菌法操作步骤（三）手提式高压蒸汽灭菌锅手提式高压蒸汽灭菌锅全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅操作步骤（三）操作步骤（三）（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例以手提式高压蒸汽灭菌锅为例） 1. 1.装锅先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭菌物品。菌物品。2.2.加盖 将盖上的排气软管插入内层灭菌锅的排气槽内。再将盖上的排气软管插入内层

14、灭菌锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。3.3.灭菌 加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，升温至关上排气阀，升温至l21l21时维持时维持1520min1520min。 4.4.降温取物 灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至0 0时，打开排气阀，开盖取物。时，打开排气阀，开盖取物。加压蒸汽灭菌法加压蒸汽灭菌法0.1MPa0.1MPa，121121，20min20min灭菌灭菌注意事项：注意事项：切勿忘记加水，

15、加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。引起炸裂事故。锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。所需压力。压力一定要降到压力一定要降到“0”0”时，才能打开排气阀，开盖取物。时，才能打开排气阀，开盖取物。灭菌全程必须有人看守。灭菌全程必须有人看守。紫外线灭菌法紫外线灭菌法适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过紫外线灯距照射物以不超过1.2m1.2m为宜。为宜。若紫外线照射与若紫外线照射与3%

16、5%3%5%的石炭酸溶液或的石炭酸溶液或2%3%2%3%的的来苏尔等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。来苏尔等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。注意事项：注意事项：紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。过滤除菌法过滤除菌法适用于适用于不耐热的液体物质不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶（如维生素、血清、酶等热敏性物质）。等热敏性物质）。滤膜孔径：滤膜孔径：0.22m0.22m缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。思考题思考题培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？后的培养基是无菌的？P2P2（1 1）在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？么？ P2P2（）（）在干热灭菌操作过程中应注意