PTEN基因诱导人脑胶质瘤SHG┐44细胞凋亡及bcl┐2表达下调

1、PTE睚因诱导人脑胶质瘤 SH3 44细胞凋亡及bcl I 2表达下调付洛安章翔李侠费舟郭衍高大宽【关键词】神经胶质瘤关键词：神经胶质瘤；基因；脱噬作用;bcl-2摘要：目的 探讨PTE漉因对人脑胶质瘤SHG-44田胞凋亡及凋 亡相关基因bcl-2表达的阻碍,说明PTE漉因抑制肿瘤细胞增殖的机 制.方式PTEN基因体外转染SHG-44田胞,挑选阳性细胞克隆,以原 位杂交、免疫组化方式检测 PTEN®因的表达情形；采纳透射电镜、流 式细胞仪和核DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞的凋亡情形；以防止疫荧 光法检测bcl-2基因的表达.结果PTEN基因转染的SHG-44细胞有 PTENg白的表达.

2、透射电镜下可见转染PTENS因后细胞核染色质浓缩 边集、胞质浓缩、核碎裂及凋亡小体形成等典型的凋亡表现；流式细胞 仪显示细胞周期从G1期到S期发生抑制,而且在G1期峰前显现一明 显的凋亡峰衿；细胞核DN碱脂糖凝胶电泳呈现凋亡细胞特有的梯 状条带；bcl-2的表达也显著下调.结论PTENM因可诱导SHG-44I田胞 凋亡,并下调bcl-2蛋白的表达,这可能是PTENS因抑制肿瘤细胞增 殖的分子机制之一.Keywords:glioma；genes；apoptosis；genes , bcl-2Abstract:AIM To investigate the effects of exotic PTE

3、N on the apoptosis and expression of bcl-2gene in human brain glioma SHG-44cells and to probe into the mechanism thatPTENgene inhibits the proliferation of the tumor Human glioma SHG-44cells were transfected with a plasmid vector containing PTENgene in vitro , and then positive cell clones were sele

4、cted and ex-pression of PTEN gene was examined by in situ hybridization and immunohistochemistry detect the apopto-sis , examinations of transfected cells were performed by transmission electronic microscope , flow cytometry and nu-cleus DNA agarose gel expression of bcl-2was also detected by immuno

5、fluorescent i SULTSSHG-44cells stably transfected with PTENgene were obtained by selection , and expression of PTENgene was able to be body and changes of ul-trastructure , including the concentration , side-accumulation of the nuclear chromatin and the fragmentation of the nucle-ar were detected by

6、 transmission electron cycle detected by flow cytometry showed that the percentage of cells increased in G1and decreased in S visible apoptosis peak (% prior to the peak of G1also was found by characteristic DNA ladder was found in the agarose gel electrophoresis of the nucleus DNAof trans-fected ex

7、pression of bcl-2gene was down-regulat-ed in PTEN gene SHG-44cells caninduce apoptosis and down-regulation of expression of bcl-2gene in SHG-44cells , which maybe one of the rea-sons that PTENgene inhibits the proliferation of human tu-mor cells.0引言PTEN®因是1997年觉察的定位于人体第10q23染色体上的 肿瘤抑制基因,人类多种肿瘤组

8、织中伴有该基因的缺失1.许多学者已研究了人脑胶质瘤标本和细胞系中PTEN8因的变异,其中Duerr等2以SSC而直接测序法研究了 331例胶质瘤中PTEN勺表达, 觉察10q23染色体上PTEN8因位点杂合性缺失LOH发生频率较高, 提示该基因的突变或缺失可能与胶质瘤的发生和进展紧密相关.咱们将外源性人PTEN8因导入该基因缺失的SHG-44胶质瘤细胞系中,以 揭露外源性PTENS因对人脑胶质瘤细胞系凋亡和凋亡相关基因bcl-2表达的阻碍,探讨PTEN®因抑制肿瘤细胞增殖的分子机制.1材料和方式材料SHG-44胶质瘤细胞系苏州医学院；RPMI1640培育 基、胰蛋白酶Hyclone;

9、脂质体lipo-fectamine Gibco;喋吟霉素Clontech ;pBP-PTEN及 pBP质粒美国 Furnari 博士惠赠；各类限制性内切酶Clontech ;鼠抗人PTEh#抗,鼠抗人bcl-2单抗(Santa Cruz) ;FITC 标记的羊抗鼠 IgG (Jackson), 6wk龄 BALB/c裸鼠(第四军医大学实验动物中央).方式%菌株,挑选氨节抗性的克隆,扩赠培育,碱裂解法提取纯化质 粒DNA脂质体介导法将pBP-PTE脚口 pBP载体别离转染对数生长期的 SHG-44田胞.挑选培育基中喋吟霉素浓度为 2mg L-1,维持挑选30d,挑选阳性细胞克隆,扩增培育.别离将

10、成功 转染 pBP-PTENF口 pBP载体的 SHG-44细胞命名为 SHG44-pBP-PTENl SHG44-pBP 田胞.PTENM因表达的检测pBP-PTENg EcoRI和Cla I双酶切以 后,回收1212bp的人全长PTENS因片断,随机引物法标记杂交探针, 利用原位杂交方式另U离检测 SHG44-pBP-PTENSHG44-pB环口 SHG44田 胞.同时用免疫组化方式检测PTENS白在上述3种细胞中是不是表达. 一抗为鼠抗人PTENII克隆抗体,1 1000稀释,具体操作见博士德公 司SABC式剂盒说明书.以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照.细胞周期、超微结构、生长速度及核

11、 DNA电泳检测3种细 胞别离经L-1胰蛋白酶消化成单细胞悬液后,进行以下检测：各取 约1X106个细胞,PBS洗涤2遍,预冷的750mL L-1乙醇固定,PI染色,流式细胞仪行细胞周期检测.各取约1X106个细胞,1000r min-1离心5min,细胞沉淀以20g L-1戊二醛固定,常规包埋,切片, 双铅染色后透射电镜检测.别离接种于6孔板,每种细胞接种7孔, 每孔约1X104个细胞,每日取1孔细胞进行计数,绘制细胞生长曲 线.各取约1X106个细胞,PBSa涤2遍后,采纳氯仿-酚抽提法提 取细胞核DNA取15区L核DNAk样,行15g L-1琼脂糖凝胶电泳细 胞核DNA分析,EB染色后紫

12、外灯下观看.bcl-2蛋白表达的检测3种细胞各约1X106个,40g L-1多聚甲醛固定,含1mL L-1 Triton X-100的PB够 4c下作用5min,参加1 80稀释的鼠抗人bcl-2单抗, 室温孵育,再参加1 100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG,利用流式细 胞术检测bcl-2特异性细胞的平均荧光强度MIF,以判定bcl-2表 达情形.SHG44细胞作为对照,计算 SHG44-pBP-PTE和SHG44-pBPffl 胞MIF与对照细胞 MIF的比值.阴性对照为SHG44细胞不加鼠抗人 bcl-2单抗,代之以小鼠IgG.统计学处置：数据以SPS费计软件包进行x 2查验. 2结果

13、PTEN基因转染SHG 44细胞成功将pBP-PTE脚口 pBP载体 转染入SHG44肿瘤细胞,取得阳性转染的细胞克隆,相差显微镜下 SHG44-pBP-PTENSHG44-pBPW SHG44E种细胞之间,形态无明显不PTEN表达的检测原位杂交显示仅SHG44-pBP-PTENE胞有 PTEN基因 mRNA勺表达FiglA, 1B.免疫组化显示：SHG44-pBP和 SHG-4垄田胞中PTENS白阴性,而SHG44-pBP-PTEN胞中该蛋白表达 阳性,可见胞质中大量的棕黄色颗粒FigIC, 1D.表1流式细胞仪显示细胞周期转变略PTEN基因对SHG 44细胞周期、超微结构、生长速度及核 D

14、NA电泳的阻碍 流式细胞仪检测细胞周期显示 SHG44-pBP-PTEN3 胞的G1期细胞数量增加,S期细胞减少,从G1期到S期发生抑制, G1峰左侧显现凋亡峰A?,所占比例为.SHG-4琳口 SHG44-pBP田胞 周期正常Tab1.3种细胞生长曲线可见SHG44-pBP-PTEN3胞的 生长曲线平缓,生长速度较另两种细胞明显降低Fig2.透射电镜 下,可见SHG44-pBP-PTEN胞核染色质浓缩、边集,呈境遇清楚的块 状或半月状,亦有细胞核碎裂,胞质浓缩；胞质内细胞器较完整,并检 测到明显的凋亡小体,为典型的肿瘤细胞凋亡表现,SHG-44和 SHG44-pBP田胞超微结构未见异样Fig3

15、.细胞核DNAt泳分析可 见SHG44-pBP-PTEN3胞核DNAS解为180200bp及其整倍数的寡核 甘酸片段,形成典型的阶梯状电泳图谱 DNA ladder .SHG-44及 SHG44-pBP田胞核DNAX在加样孔周围显现基因组条带,无DNAadder 形成Fig4.图1 图3略bcl 2表达水平转变流式细胞仪分析结果显 示:SHG44-pBP-PTEM田胞的 MIF为对照细胞 MIF的 (P<);而 SHG44-pBP田胞的MIF为对照细胞乂尸的结果说明PTEN®因转染可 明显抑制细胞bcl-2蛋白的表达.图4略3讨论研究说明PTEN®因位于人类第

16、10q23染色体上,具有9个外 显子,其序列内含有由1212个核甘酸组成的开放阅读框,编码 403 个氨基酸组成的蛋白质3 .Chiariello 等4检测了 41例原发 性胶质母细胞瘤中PTE虚因的表达,结果显示59%勺标本中存在10q23 染色体上PTEhB点的杂合性缺失.也有学者比拟了不同病理品级胶质 瘤中PTEN勺表达量,证实低分化胶质瘤中 PTEN勺突变率明显高于高 分化肿瘤,提示PTEN勺突变与胶质瘤的恶性进展紧密相关.目前有关PTEN®因抑制肿瘤细胞增殖的机制尚不明晰,但有 研究以为PTENI能是一种凋亡诱导基因.本实验将PTE盅因体外转染 SHG-44胶质瘤细胞系,挑

17、选阳性转染的细胞克隆后作相关检测, 结果 证实转染PTEN®因的SHG44交质瘤细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生抑制,而且在G1期前显现了明显的凋亡峰.细胞透射电镜 显示染色质浓缩并边集于核膜,形成境遇清楚的颗粒块状或新月形小 体,细胞质也浓缩,有的胞核裂解成质膜包绕的碎片,并脱落形成凋 亡小体,为明显的凋亡表现.氯仿-酚抽提法提取细胞核DNA亍L-1琼 脂糖凝胶电泳,于PTEN®因转染组细胞泳道上觉察了典型的“梯状 条带,这是由于细胞凋亡时核小体间连接部双股螺旋断裂形成多个 180200bp及其整数倍大小的寡核甘酸碎片,因此会在含澳化乙锭的 琼脂糖凝胶电泳上呈现典

18、型的“梯状条带,目前以为这是细胞凋亡 的特点性转变之一.以上实验结果均证实PTENS因可诱导SHG-4以脑 胶质瘤细胞凋亡.诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制较为复杂,其中下调凋 亡抑制基因的表达是一种重要的分子机制 .bcl-2 蛋白是一种膜结合 蛋白,存在于细胞的线粒体、核膜和内质网膜上,具抑制凋亡的作用 目前已取得公认6.有学者证实bcl-2能拮抗bax等介导的肿瘤细 胞凋亡7.本研究在证实PTENS因可诱导肿瘤细胞凋亡的同时, 检测到bcl-2蛋白的表达下调,提示PTENS因诱导的肿瘤细胞凋亡可 能是通过下调bcl-2的表达而实现的.综上所述,PTENS因是与脑胶质瘤发生和进展紧密相关的一 种

19、抑癌基因,将其导入到该基因缺失的胶质瘤细胞系中, 可下调bcl-2 蛋白的表达,并进一步诱导肿瘤细胞的凋亡,这将为胶质瘤的基因医 治提供新的实验依据.参考文献:1 Li DM Sun , encoded by a candidate tumor suppressor locus , is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta J .Cancer Res, 1997;57 (11) :2124-2129.2 Duerr EM, Rollbrocker B , Hayashi Y, Tumber K, Mori mutations in gliomas and glioneuronal tumorsJ .Onco-gene ,1998;16 (17) :2259-2264.3 Jing JJ, Zhang X, WuJVV Liu XZ, CaoWD Fan QT Duan between PTEN and CB expression and inva-sion of astrocytomaJ .Di-si Junyi DaxueXueb