生化分离技术

1、生化分离技术生化分离技术DNA,RNA和蛋白质的提取和蛋白质的提取 学生：徐泽彬学生：徐泽彬 专业：生物化工专业：生物化工 学号：学号：201306032提 要生物大分子提取1核酸传统提取法2核酸固相提取法3蛋白质的提取4生物大分子生物大分子 与化学产品相比，生物大分子的制备有以下生物大分子的制备有以下主主要特点要特点：生物材料的组成极其复杂组成极其复杂，有数百种至几千种化合物。生物大分子的含量极微含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。生物大分子离开了生物体内的环境极易失活极易失活，因此如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子

2、强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响综合影响，很难准确估计和判断。核酸提取的历史核酸提取的历史 核酸是核酸是1869年年米歇尔米歇尔(F.Miescher)在在脓液脓液 白细胞中白细胞中发现的，他当时发现的，他当时称之为核素。阿称之为核素。阿尔特曼尔特曼(R.Altmann)于于1889年认识其年认识其酸性后，定名为酸性后，定名为核核 酸。核酸分酸。核酸分为核糖核酸为核糖核酸 (RNA)和脱氧核和脱氧核糖核酸糖核酸(DNA)两两大类。大类。核酸提取的历史核酸提取的历史 质粒质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从大小从1-200 kb不等，为

3、双链、闭环的不等，为双链、闭环的DNA分子，并分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息拷贝数，并表达所携带的遗传信息。核酸提取的历史核酸提取的历史 1869年，瑞士医师弗雷德里希米歇尔首例成功的进行了核酸提取。起初，他关注于组成白细胞各种蛋白质，并指出蛋白质是细胞质的主要成分。但在随后的测试试验中发现，当加入酸性溶液时溶液中生成一种沉淀物，再加入碱性溶液

4、时沉淀继而溶解消失。米歇尔首例提取出粗糙的DNA，米歇尔成功从细胞中提取出DNA后，一些研究者纷纷效仿，并在材料、试剂的应用上进行了不断的探索，由此发展了许多核酸的生物分子提取技术。EB-CsCl密度梯度离心法TRIzol法CTAB法SDS法oligo(dT)-纤维素柱层析法核酸传统提核酸传统提取方法取方法核酸传统提取方法核酸传统提取方法TRIzol法法异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法） 原理： 核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水

5、性，因此向水层移动。核酸传统提取方法核酸传统提取方法TRIzol法法 TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。核酸传统提取方法核酸传统提取方法SDSSDS法法SDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并

6、降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。核酸传统提取方法核酸传统提取方法SDSSDS法法动物组织动物组织 抽提抽提酒精沉淀酒精沉淀液氮研磨液氮研磨或匀浆或匀浆上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤SDS法实验流程（以动物组织为例）法实验流程（以动物组织为例）核酸传统提取方法核酸传统提取方法CTAB法法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂

7、，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。核酸传统提取方法核酸传统提取方法CTAB法法 Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏 EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中 CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离 -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除核酸传统提取方法核酸传统提取方法CTAB法法植物材料植物材料 抽提抽提核酸沉

8、淀核酸沉淀液氮研磨液氮研磨上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤CTAB法实验流程法实验流程核酸传统提取方法核酸传统提取方法EB-CsCl密度梯度离心法密度梯度离心法EB-CsCl密度梯度离心法 在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。 蛋白质由于密度小而浮于液面 RNA密度大而沉于管底 各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部 核酸传统提取方法核酸传统提取方法EB-CsCl密度梯度离心法密度梯度离心法核酸传统提取方法核酸传统提取方法EB-CsCl密度梯度离心法密度梯度离心法 不同分子构型的DNA与EB的结合能力不同，

9、密度下降也不同，因而可将它们有效分离开。 染色体DNA、开环质粒DNA等可嵌入更多的EB，因而密度下降较多 闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入而结合量少，密度下降较少 核酸传统提取方法核酸传统提取方法oligo(dT)-纤维素柱层析法纤维素柱层析法oligo(dT)-纤维素柱层析法 oligo(dT)-纤维素柱层析法是mRNA制备的一个标准方法。它是以oligo(dT)-纤维素填充层析柱，加入待分离的总RNA样品，其中poly(A)+RNA在高盐条件下，通过碱基互补，与oligo(dT)-纤维素形成稳定的RNA-DNA杂交体，洗去未结合的其它RNA，然后在低盐缓冲液中洗脱并回收pol

10、y(A)+RNA。从哺乳动物细胞提取大量的非放射性RNA 时，oligo(dT)-纤维素柱层析法是首选方法，回收的poly(A)+RNA量可达总RNA的1%10%。但该法分离速度慢，易阻塞，不适合同时对多个标本的处理，而且很难回收全部的poly(A)+RNA，故不适合对少量RNA样品的分离。磁性颗粒二氧化硅基质法硅藻土玻璃颗粒阴离子交换材料核酸固相提取方法核酸固相提取方法核酸固相提取方法 市场上大多 数商业核酸抽提试剂采用固相纯化法 ，相比于传统方法 。固相抽提更快速和高效 ，它解决了许多 液- 液抽提存在的许多问题, 如分离不完全等 。固相系统抽提核酸依赖缓冲液的pH 值和盐浓度来吸附核酸,

11、 其吸附过程基于以下原理: 在离液条件下氢与亲水基质发生相互结合作用, 在水溶液中则通过阴离子交换柱发生离子交换 , 以及通过亲和力和大小排除机制 。核酸固相提取方法核酸固相提取方法二氧化硅基质法二氧化硅基质法二氧化硅基质法 二氧化硅基质提取的基本原理：带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子有很高的亲和力。在高盐的酸性条件下，DNA与二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离子强度的TE缓冲液或蒸馏水洗脱结合的DNA分子。核酸固相提取方法核酸固相提取方法二氧化硅基质法二氧化硅基质法核酸固相提取方法核酸固相提取方法二氧化硅基质法二氧化硅基质法核酸固相提取方法核酸固相提取方法玻璃颗粒玻璃颗粒玻

12、璃颗粒 玻璃颗粒、粉末和玻璃珠都可用于核酸纯化。例如，从琼脂糖凝胶中分离DNA涉及到用离液盐来促进DNA 与普通硅酸盐玻璃、含铅玻璃和硼硅玻璃( 玻璃纤维滤器) 结合。核酸吸附到玻璃底物上的机制多半与吸附色谱法类似。在离液盐存在下，硅胶和玻璃颗粒的混合物可以把核酸从其它物质中分离出来，因此这种混合介质也可用于核酸纯化。核酸固相提取方法核酸固相提取方法硅藻土硅藻土硅藻土 硅藻土中二氧化硅的含量高达94% , 它一直被应用于过滤和层析。在离液盐 存在的 情况下, 它可将 DNA固定在其颗 粒表面, 因此也可用于DNA的纯化。 所得到的硅藻土与DNA结合物用含醇的缓冲溶液处理，从而DNA被洗脱出来。

13、核酸固相提取方法核酸固相提取方法磁性颗粒磁性颗粒磁性颗粒 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁（Magnetic Silica Particle）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COOH）等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，

14、基于这种技术的试剂盒，名称前都有Mag-Bind。核酸固相提取方法核酸固相提取方法磁性颗粒磁性颗粒生物磁珠就是指具有细小粒径的超顺磁微球 1.在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散2.有合适的且差别较小的粒径，保证了足够强的磁响应性又不会沉降3.有丰富的表面活性基团，可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离核酸固相提取方法核酸固相提取方法阴离子交换材料阴离子交换材料阴离子交换材料 阴离子交换树脂是利用阴离子交换原理的一个典型代表。它是基于树脂表面带正电荷的二乙胺基乙基纤维素(DEA E)基团和DNA骨架上带负电荷的磷酸之间的相互作用。阴离子交换树脂由具

15、有大孔径、亲水表面涂层和高电荷密度的特定硅球组成。树脂 大的表面积可密集藕合DEAE基团 。树脂可在较宽的 p H (6- 9 ) 和 / 或盐浓度(0. 1 -0. 6M)范围工作，从而可最佳化DNA从RNA和其它杂质中分离。因此，缓冲液的盐浓度和pH 值是决定核酸结合或从柱上洗脱下来的主要因素之一 。DNA可在一个宽的盐浓度范围与DEAE基团相结合，用中浓度的盐缓冲液洗去柱上的蛋白质和 RNA等杂质, 最后用高盐缓冲液将仍结合在柱上DNA洗脱下来。磁性颗粒离子交换色谱亲和层析凝胶色谱免疫印迹凝胶电泳蛋白质提取蛋白质提取方法方法蛋白质提取方法蛋白质提取方法离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱

16、原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。蛋白质提取方法蛋白质提取方法离子交换色谱离子交换色谱 离子交换剂的选择 a. 强、弱离子交换剂的选择： 强型：适用的pH范围广，制备无离子水 弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质 b. 阴、阳离子交换剂的选择：蛋白质的稳定性 若pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂蛋白质提取方法蛋白质提取方法离子交换色谱离子交换色谱33阴离子交换剂分离蛋白质阴离子交换剂分离蛋白质的的过程过程平衡平衡吸附吸附去吸附去吸附分离结束分离结束再生再生+低盐低盐高盐高盐利用不同利用不同盐浓度将盐浓度将不同蛋白不同蛋白质质洗洗脱下脱下來來Cl-Cl-Cl-Cl-C

17、l-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-蛋白质提取方法蛋白质提取方法凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱法的原理分子筛效应： 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 依据的特性是：蛋白质分子量的大小。蛋白质提取方法蛋白质提取方法凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示蛋白质提取方法蛋白质提取方法亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析(Affinity

18、 Chromatography)(Affinity Chromatography) 由吸附层析发展起来的由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。纯化蛋白质的最好方法。 又称：又称： 功能层析（功能层析（function chromatographyfunction chromatography） 生物专一吸附（生物专一吸附（biospecific adsorptionbiospecific adsorption） 选择层析（选择层析（selective chromatographyselective chromatography）蛋白质提取方法蛋白质提取

19、方法亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析原理原理 利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；受体；RNA和其互补的和其互补的DNA等。等。 将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。离的

20、物质洗脱下来，实现分离提纯。蛋白质提取方法蛋白质提取方法亲和层析亲和层析亲和层析方法：亲和层析方法：A A 层析前：制备亲和层析剂层析前：制备亲和层析剂 选择选择根据欲分离物质特性根据欲分离物质特性 配基配基 选择选择根据配基分子大小及基团特性根据配基分子大小及基团特性 母体母体B B 洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用偶联偶联亲和层析剂亲和层析剂蛋白质提取方法蛋白质提取方法亲和层析亲和层析+CCC配基配基蛋白质蛋白质1.配基固相化配基固相化2.亲和吸附亲和吸附固体载体固体载体3.解吸附解吸附蛋白质提取方法蛋白质提取方法凝胶电泳凝胶电泳电泳原理： 电泳

21、利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。常见电泳类型：琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小、形状。电泳迁移率完全取决于分子的大小。蛋白质提取方法蛋白质提取方法凝胶电泳凝胶电泳SDS测定蛋白质分子量的方法 使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。蛋白质提取方法蛋白质提取方法凝胶电泳凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳原理 双向PAGE电泳是由两种类型的PAGE组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行第二向电泳。如这二向电泳体系pH及凝胶浓度完全相同，则电泳后样品中不同组分的斑点基本上呈对角线分布，对提高分辨率作用不大。1975年，OFarrell等人根据不同生物分子间等电点及相对分子质量不同的特点，建立了以第一向为IEF-PAGE，第二向为SDS- PAGE的双向分离技术，简称为IEF/SDS-PAGE；基本原理与IEF-PAGE，SDS-P