中分子总量测定及临床意义（国建琴）05－7

1、 廊坊市爱尔血液净化器材厂 国建琴 中分子总量测定及临床意义中分子总量测定及临床意义中分子检测中分子检测n检测方法采用第一军医大学改进的检测方法采用第一军医大学改进的氏紫外吸收法。主要是测血浆氏紫外吸收法。主要是测血浆MMSMMS总量，而不考虑总量，而不考虑MMSMMS的组分细节，操作简单、微量、快速，可以在临的组分细节，操作简单、微量、快速，可以在临床上广泛应用。用于监测体内中分子的含量，也可床上广泛应用。用于监测体内中分子的含量，也可以观察血液灌流前后血浆以观察血液灌流前后血浆MMSMMS的清除率。的清除率。肖应庆教授来我厂指导中分子检测肖应庆教授来我厂指导中分子检测 指存在于体液中分子量

2、在指存在于体液中分子量在30030050005000DaltonsDaltons之间的一类具有毒性作用的中等分子量的物质之间的一类具有毒性作用的中等分子量的物质（Middle Molecular Substance MMSMiddle Molecular Substance MMS）, ,简称简称中分子。中分子。 在在7070年代，年代，BabbBabb等提出了中分子物质假等提出了中分子物质假说，提出尿毒症中毒本源性物质是中分子，说，提出尿毒症中毒本源性物质是中分子，而不是传统中认为的血中尿素、肌酐、尿而不是传统中认为的血中尿素、肌酐、尿酸等小分子物质的含量。酸等小分子物质的含量。 n其后的研

3、究证明其后的研究证明MMSMMS确是尿毒症患者体内确是尿毒症患者体内重要的病源物质。重要的病源物质。n目前的研究表明：尿毒症患者体内至少目前的研究表明：尿毒症患者体内至少有有200200多种物质的浓度高于正常人。按其多种物质的浓度高于正常人。按其分子量可分为分子量可分为3 3大类：小分子水溶性毒素、大类：小分子水溶性毒素、中大分子类毒素和能与蛋白质结合的毒中大分子类毒素和能与蛋白质结合的毒素。素。n现在科学的发展已进入了组分分析阶段，现在科学的发展已进入了组分分析阶段，像瘦素、像瘦素、PTHPTH、TNF-aTNF-a、IL-6IL-6等等2222种中分种中分子毒素能被准确定量分析，但检测费用

4、子毒素能被准确定量分析，但检测费用昂贵。昂贵。n目前临床开展总量测定具有实际指导意目前临床开展总量测定具有实际指导意义。义。取干净的取干净的7512 mm（内径）试管，按下表操作：内径）试管，按下表操作： 血血 浆浆 0.1 ml 0.500 mol/L HClO4 0.2 ml 振匀，按振匀，按“沉淀温度沉淀温度时间曲线时间曲线”放置一定时间放置一定时间 蒸蒸 馏馏 水水 1.1 ml摇匀，摇匀，28003200g离心离心10分钟分钟 取取 上上 清清 1.0 ml 蒸蒸 馏馏 水水 2.0 ml混匀，在波长混匀，在波长254 nm处，光径处，光径cm，用蒸馏水作空白用蒸馏水作空白调零，测定

5、吸光度。调零，测定吸光度。血浆中分子物质总量测定操作步骤血浆中分子物质总量测定操作步骤检验人员使用微量加样器在试管里加样 离心机 检验人员使用紫外分光光度计测中分子含量离心机转速与离心力的列线图离心机转速与离心力的列线图 测定结果用测定结果用“条件单位（条件单位（u u）”表示。完全按上表示。完全按上述条件进行操作，以最后测得的吸光度述条件进行操作，以最后测得的吸光度1 1A A为为1 1个个条件单位。结果报告，标本以分升（条件单位。结果报告，标本以分升（dldl）为单位，为单位， 即即“u/dl”u/dl”。假设测得一标本的吸光度为假设测得一标本的吸光度为0.2360.236，则表示为则表示

6、为“236“236u/dl”u/dl”。因为测定时实际取用标因为测定时实际取用标本本0.1 0.1 mlml，现用现用“dl”dl”来表示，扩大了来表示，扩大了10001000倍。倍。所以测得的吸光度相应也要扩大所以测得的吸光度相应也要扩大10001000倍。倍。 通过加酸沉淀蛋白，离心除去绝大部分通过加酸沉淀蛋白，离心除去绝大部分大分子物质（血浆蛋白）；测定中分子物质大分子物质（血浆蛋白）；测定中分子物质的吸光度时的吸光度时 ，选择合适的吸收波长（，选择合适的吸收波长（254 254 nmnm），），尽量避开大、小分子物质（酸溶性蛋尽量避开大、小分子物质（酸溶性蛋白、肌酐、尿素等）的干扰。白

7、、肌酐、尿素等）的干扰。 测测 定定 原原 理理尿毒症患者血浆HClO4沉淀上清液健康人血浆HClO4沉淀上清液Sephadex G-25 微量柱分离血浆中分子层析图谱微量柱分离血浆中分子层析图谱 是为在临床推广应用是为在临床推广应用 “ “中分子物质含中分子物质含量量” ” 这一指标。开展本法无需高档的仪器这一指标。开展本法无需高档的仪器和特殊的试剂，经济快速，操作方法简单，和特殊的试剂，经济快速，操作方法简单，标本用量少，出结果快，适合临床需要；基标本用量少，出结果快，适合临床需要；基层厂矿、部队医院和乡、镇医院都可以开展。层厂矿、部队医院和乡、镇医院都可以开展。 设设 计计 思思 想想

8、为为保证血浆中分子物质（保证血浆中分子物质（MMSMMS）总量测定结果的总量测定结果的一致性，现将操作方法规范如下：一致性，现将操作方法规范如下：1. 1. 测定样品一律使用测定样品一律使用肝素或肝素钠抗凝血浆肝素或肝素钠抗凝血浆。抗。抗凝管制备：用微量进样器预加临床用肝素或肝素钠凝管制备：用微量进样器预加临床用肝素或肝素钠注射液（注射液（1250012500u/2mlu/2ml）约约 10 10 lmllml。血浆中分子物质血浆中分子物质总量测定方法规范化要求总量测定方法规范化要求2. 2. 一般采空腹静脉血，一般采空腹静脉血，离心（离心（15001500转转/ /分分） 1010minmi

9、n分离血浆，在分离血浆，在2 2小时内进行测定；如不能及小时内进行测定；如不能及时测定，必须将分离血浆移于另一干净试管或带时测定，必须将分离血浆移于另一干净试管或带盖小塑料离心管中盖小塑料离心管中 ，密封保存。，密封保存。 如在一周内测如在一周内测定可置定可置44冰箱；如超过一周测定，必须冰箱；如超过一周测定，必须保存在保存在00以下以下。在。在20 20 或更低温度下，保存可达数或更低温度下，保存可达数月至几年。冰冻血浆复溶后一般出现絮状物，不月至几年。冰冻血浆复溶后一般出现絮状物，不能离心或过滤除去沉淀，但在测定前必须充分振能离心或过滤除去沉淀，但在测定前必须充分振荡混合均匀。荡混合均匀。

10、3. 3. 加样器必须经常校正，加样器必须经常校正， 保证加样量准确为保证加样量准确为100 100 l l。血浆样品一定要加到管底血浆样品一定要加到管底, ,切勿沾附于试管壁。切勿沾附于试管壁。测定用试管大小以测定用试管大小以757512 12 mmmm（内径）为宜。内径）为宜。4. 4. 沉淀血浆蛋白用试剂，厂家及批号不限，但使沉淀血浆蛋白用试剂，厂家及批号不限，但使用的浓度一定要准确用的浓度一定要准确校正至校正至0.500 0.500 mol/Lmol/L（校正时校正时必须稀释至必须稀释至0.1 0.1 mol/Lmol/L左右进行）。左右进行）。 5. 5. 蛋白沉淀剂的加量（蛋白沉淀

11、剂的加量（200 200 l l）也必须准确。也必须准确。可从测定管的中部或更低靠管壁加入，振荡时不可从测定管的中部或更低靠管壁加入，振荡时不要使样品沾附管壁高于要使样品沾附管壁高于1 1 cmcm。 6. 6. 关于沉淀放置时间，按关于沉淀放置时间，按“沉淀温度沉淀温度时时间曲线间曲线”选择，选择， 计时务必精确到计时务必精确到5 5秒以内。从加秒以内。从加入蛋白沉淀剂时便开始计时，入蛋白沉淀剂时便开始计时， 而不是从振荡结束而不是从振荡结束时开始计时。时开始计时。 测定测定环境温度应在环境温度应在1717以上，以上， 2929以下，以下，低于低于1717时，时，“沉淀温度沉淀温度时间曲时间

12、曲线线”已不再适用。已不再适用。 7. 7. 加入加入1.1 1.1 mlml水之后，振荡不能太剧烈，只要见到水之后，振荡不能太剧烈，只要见到管底沉淀悬浮起来即可。如振荡过于剧烈，可使测定管底沉淀悬浮起来即可。如振荡过于剧烈，可使测定结果偏高；结果偏高； 反之，振荡轻微，测定结果又会偏低。反之，振荡轻微，测定结果又会偏低。8. 8. 及时离心，离心时间为及时离心，离心时间为1010 1 1分钟。离心机的厂家分钟。离心机的厂家及型号不限，离心力控制在及型号不限，离心力控制在 2500 25003500 3500 g g 范围内。范围内。离心力的计算依据离心半径离心力的计算依据离心半径( (cm)

13、cm)和准确的离心转速和准确的离心转速( (r r min min）参数。离心半径的正确测量是从离心转轴中心参数。离心半径的正确测量是从离心转轴中心至离心状态离心管底试样的水平距离。至离心状态离心管底试样的水平距离。 9. 9. 吸取上清吸取上清1.0 1.0 ml , ml , 计量要准确，并不能混计量要准确，并不能混有沉淀。有沉淀。 10. 10. 测定用紫外分光光度计，测定用紫外分光光度计， 厂家及型号不限，厂家及型号不限，波长要校准至波长要校准至254254 1 1nmnm。使用数码显示的紫外分光使用数码显示的紫外分光光度计，如光度计，如752752型，还需校正透光率型，还需校正透光率

14、( (T T）与吸光度与吸光度（A A）的对数转换斜率（仪器本身能自动校正的除的对数转换斜率（仪器本身能自动校正的除外外) )。此外，光源灯发出的紫外光能量和光电管的。此外，光源灯发出的紫外光能量和光电管的灵敏度以及仪器的其他性能，灵敏度以及仪器的其他性能， 都是可能影响测定都是可能影响测定结果的因素。结果的因素。 一般来说，只要是出厂合格的产品，在使用过程一般来说，只要是出厂合格的产品，在使用过程中能按操作规程正确操作，中能按操作规程正确操作， 平时注意仪器的维护保平时注意仪器的维护保养，养， 再加上定期校正、检修，就可避免由于测定仪再加上定期校正、检修，就可避免由于测定仪器带来的误差。器带

15、来的误差。 11. 11. 注意石英比色杯之间透光度的一致性，配套后注意石英比色杯之间透光度的一致性，配套后就不要与其他石英比色杯串用。就不要与其他石英比色杯串用。 经常保持比色杯的经常保持比色杯的清洁干净，用后及时冲洗，置无尘干燥处保存。清洁干净，用后及时冲洗，置无尘干燥处保存。 1. 1. 测定对象为经体检确定是健康人，不宜用测定对象为经体检确定是健康人，不宜用献血员样品；献血员样品； 2. 2. 一般采空腹静脉血，不能有明显溶血；年一般采空腹静脉血，不能有明显溶血；年龄分组，以龄分组，以1010岁为一个年龄组（岁为一个年龄组（1010岁以下，岁以下，11112020岁，岁，6161707

16、0岁，岁，7171岁以上）；岁以上）； 3. 3. 性别分组，男女约各占一半。性别分组，男女约各占一半。新开展中分子总量测定的单位，宜先测定部分新开展中分子总量测定的单位，宜先测定部分正常值，正常值， 以检验对测定方法的掌握情况，而后再以检验对测定方法的掌握情况，而后再检测病例标本。检测病例标本。 附附1 1：正常值测定要求：正常值测定要求1. 7521. 752型紫外光栅分光光度计型紫外光栅分光光度计2. 2. LD5-2ALD5-2A低速离心机（约低速离心机（约50005000元元 / / 台）台）3. 3. 旋涡混合器（约旋涡混合器（约300300元元 / / 台）台）4. 4. 微量连

17、续可调移液器：微量连续可调移液器：QYQ1000 1QYQ1000 1支，支，QYQ100 1QYQ100 1支支5. 5. 可调定量加液器可调定量加液器 5 5 ml 2ml 2只，只，1 1 ml 1ml 1只只6. 756. 7512 12 mm ( mm ( 内径内径 ) )玻璃试管或一次性塑料试管玻璃试管或一次性塑料试管7. 7. 定时钟定时钟8. 8. 温度计温度计附附2 2：中分子物质总量测定仪器、器材：中分子物质总量测定仪器、器材v疾病诊断及其病情严重的估计 MMS总量改变可作为某些疾病诊断的指标之一，如尿毒症，肝性昏迷及急性烧伤毒血症等已经得到证实v病程变化的动态指标 因为M

18、MS总量水平的增高与某些疾病病情严重程度密切相关,可以为临床医生提供客观指标。 中分子（中分子（MMSMMS）总量测定临床意义：总量测定临床意义：v血液净化效果的观察 长期透析患者，定期进行透析治疗，虽然可以清除一些小分子毒性物质尿素、肌酐及尿酸，改善临床症状，但对中分子物质（MMS）则较难透出，可以用相对特异吸附的树脂吸附柱进行灌流，临床上以此指标观察MMS的清除效果。 中分子（中分子（MMSMMS）总量测定临床意义：总量测定临床意义：廊坊地区正常人群血浆廊坊地区正常人群血浆MMS含量测定含量测定1 1、临床资料：调查对象为体检健康的正常人、临床资料：调查对象为体检健康的正常人105105例

19、，年龄为例，年龄为 17 175454岁，平均（岁，平均（25257 7）岁；男性）岁；男性4949例，女性例，女性5656例。例。 2 2、取清晨空腹血样、取清晨空腹血样2 2mlml，加入肝素抗凝管中，离心后及时分离加入肝素抗凝管中，离心后及时分离 血浆，取样测定。血浆，取样测定。 3 3、廊坊市区、廊坊市区105105例健康成人血浆例健康成人血浆MMSMMS含量正常值为含量正常值为2402402424u/dlu/dl， 其中男性其中男性MMSMMS为为2442442424u/dlu/dl，女性女性MMSMMS为为2372372424u/dlu/dl，性别性别 之间无显著性差异（之间无显著

20、性差异（P0.05P0.05），），其中不同年龄组及同一年龄其中不同年龄组及同一年龄 组内男女性别之间均无显著性差异（组内男女性别之间均无显著性差异（P0.05P0.05） 年龄组（岁）年龄组（岁）男性男性女性女性合计合计176239208239191723919202725024412392368244243026235257219322323128合计合计4924424562372410524024 105105例血浆例血浆MMSMMS测定值（测定值（u/dlu/dl， X XSDSD） 血浆血浆MMSMMS（u/dlu/dl）男性男性女性女性合计合计1801802002002202202

21、40240260260280280合计合计3 34 41111141417170 049495 58 8191914149 91 156568 812123030282826261 1105105105105例血浆例血浆MMSMMS测定值频数分布测定值频数分布 上表可以看出，其频数呈正态分布。地区地区测定结果测定结果u/dl（XSD）地区地区测定结果测定结果u/dl（XSD）沈阳地区沈阳地区2342222长春地区长春地区2251515辽宁盘锦辽宁盘锦2272828大连地区大连地区2261919鞍山地区鞍山地区2372727北京地区北京地区2273232西安地区西安地区2192424兰州地区兰州

22、地区2242424山东淄博山东淄博2203636豫北地区豫北地区2121919郑州地区郑州地区2182323湘中地区湘中地区2352020杭州地区杭州地区2251111广西玉林广西玉林2182121广西南宁广西南宁2252525广东肇庆广东肇庆2371616北京地区北京地区2321616天津地区天津地区2242626大连地区大连地区2282727丹东地区丹东地区2142626河南平舆河南平舆2201818昆明地区昆明地区2192626广东梅县广东梅县2241818乌鲁木齐乌鲁木齐2302727辽阳地区辽阳地区2221414廊坊地区廊坊地区2402424部分地区健康人血浆中分子物质含量部分地区健

23、康人血浆中分子物质含量 由于受各种因素的影响，各地之间的血浆MMS总量有所差别，因此，须建立本地区的正常值，可以为临床提供较为可靠的检测诊断标准。实验表明，廊坊市区健康人群血浆MMS正常值为24024u/dl。本实验测定的结果与崔广山等人测定北京地区血浆中分子的含量（23216u/dl）相比，差别不大，说明本实验结果可靠，可作为廊坊市区临床正常指标参考范围。 临床应用效果临床应用效果天津武警医学院附属医院天津武警医学院附属医院n临床应用ZX-150联合HD对16例长期透析患者进行治疗，MMS下降率为21.4，其中一位患者刘某某，第一次HP+HD后，MMS由454u/dl下降到336u/dl，一

24、周后再次行HP+HD， MMS由360u/dl下降到261u/dl，基本接近正常水平，且患者其它症状改善明显。天津塘沽医院天津塘沽医院n对35例透析患者取透析前血样，经检测平均MMSu/dl，最高为569u/dl，最低为309u/dl。一次性使用血液灌流器一次性使用血液灌流器临床应用注意事项临床应用注意事项 血液灌流临床应用有三大不良反应：凝血、血压下降、致热反应，因此必须由有血液灌流经验的医生使用，使用前详细阅读使用说明书。灌流要点n1 防止凝血n2 防止血压下降n3 防止过敏反应防凝血n血液灌流不同于血液透析血液灌流器吸附剂比表面积（1000m2/g)比一般透析膜(0.81.5m2)大得多

25、,故与血液接触面也显著增加，因此HP时的肝素量比普通透析要大。n灌流平顺与否，抗凝十分重要，包括 1 患者全身肝素化 2 灌流器肝素化 3 体外循环时过程追加 灌流器的肝素化1、将灌流器与动脉管路连接时，动脉管路必须充满的葡萄糖注射液或生理盐水，防止空气进入灌流器，引起排气困难。2、先用500ml的葡萄糖注射液冲洗，避免吸附患者血糖。3、用1000ml肝素生理盐水 (每500ml盐水加20mg肝素) 冲洗，速度为100200ml/min，冲洗时，需用手轻拍及转动吸附柱，主要是清除脱落的微粒，排除气泡，同时观察有无颗粒随液体流出，如有，禁止使用。4、再用500ml生理盐水（内加100mg肝素）冲

26、洗至200ml时，将动静脉管路连接闭路循环（200ml/min）不少于20min，以保证灌流器充分肝素化。若与透析串联使用，将灌流器连接在透析器之前，一起闭路循环。 患者全身肝素化 首次剂量按mg/kgmg/kg体重。静脉给肝素10min后，才能开始血液灌流系统的体外循环。 透析患者做HP+HD,必须在透析肝素化的基础上增加肝素，首次肝素常用量1mg/kg，视患者自身情况酌情调整(监测凝血活酶时间，一般WBPTT延长80)。 如条件允许，全身肝素化可选用低分子肝素抗凝（特别是透析患者宜采用低分子肝素抗凝），指患者全身肝素化用低分子，灌流器肝素化仍使用普通肝素，是否追加视情况。 灌流过程追加肝素 灌流开始20min时，一次追加肝素58mg，以后每半小时一