大肠杆菌的培养

1、大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白月东培养基的配方：液体培养基 牛肉膏 3.0g蛋白月东10.0g氯化钠 5.0g水 1000mlpH 7.4-7.6固体培养基在液体培养基的根底上再参加1.5 % 2.0 %的琼脂1 试管斜面与平板的制备 称量 按培养基配方比例依次准确称取蛋白月东、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中. 熔化在上述烧杯中先参加少于所需要量的水,用玻璃棒搅 匀,然后,在石棉网上加热使其溶解,药品完全溶解后, 补充水到所需的总体积.将称量好的1.8 %琼脂放入已溶的药品中,再加热熔化,最后补充所损失的水分.(3) 调PH在未调PH前,先用精密PH试纸测量培养基的原始PH,如果偏酸,用滴

2、管向培养基中逐滴参加 1mol/L NaOH, 边加边搅拌,并随时用PH试纸测基 PH直到PH到达7.4-7.6 .反之用1mol/L HCl进行调节. 分装 将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中.具试管 装量不超过管高的1/5 ,三角烧瓶的量不超过1/2加塞 培 养基分装完毕后,在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞. 包扎 加塞后,将全部试管用麻绳捆好,再在棉塞外包一层 牛皮纸,其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名 称、配制日期. 灭菌 将上述培养基以 0.1Mpa,121c ,15min高压蒸气灭 菌. 倒平板,取三个已消毒的培养皿,在无菌操作台上用三 角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基,

3、冷却.(8)搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷却至 50c左右,将试管口端搁在玻璃棒上,搁置的斜面长度以不超过试管总长的 一半为宜.2 接种大肠杆菌斜面种子(1) 取实验室储藏的大肠杆菌BL21种子,在酒精灯附近,用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌.(2) 将接种好的斜面放入37c的恒温培养箱子中培养24h.3 制备平板种子(1) 在无菌条件下,取一支保存的大肠杆菌的斜面,用无菌生理盐水将菌种冲洗下来,再用无菌生理盐水将其梯度稀 释为1倍,10倍,100倍和1000倍,用移液枪分别吸取 各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板,每次吸 取溶液100ul),然后在37 c培养箱中过夜.(12

4、) 次日,挑取生长状态好,特征明显的单个菌落,接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白月东液体培养基中 37C, 170r/min恒 温振荡培养18h作种子培养液.其后的实验中,每次实验前从种子培养液中吸取 2ml菌液接种于新鲜 灭菌的液体培养基中,37C, 170r/min恒温振荡培养使用牛肉膏蛋白月东培养基组成成分：牛肉膏3g,蛋白月东10g,Nacl 5g,琼脂1520g,水1000mL,PH7.47.6.具体配置步骤：1 .称药品 按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛 肉膏可放在小烧杯或外表皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯；也可 放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸别离

5、,立即取 出纸片.蛋白月东极易吸潮,故称量时要迅速.2 .加热溶解 在烧杯中参加少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小 火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.假设配 制固体培养基,那么将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此 过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分.3 .调pH检测培养基的pH,假设pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边 搅拌,并随时用pH试纸检测,直至到达所需pH范围.假设偏碱,那么用 lmol/L HCl进行调节.pH的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不 要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度.4 .过滤液体培

6、养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过 滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略.5,分装 按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装 时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染.分装量：固体培养基约为试管高度的1/5,灭菌后制成斜面,分装入三 角瓶内以不超过其容积的一半为宜,半固体培养基以试管高度的 1/3 为宜,灭菌后垂直待凝.6,加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花非脱脂棉制作的棉塞. 棉塞的形状,大小和松紧度要适宜,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起 到预防杂菌侵入和有利通气的作用,要使棉塞总长约3/5塞入试管口 或瓶口内,以防棉塞脱落,有些微生物

7、需要更好的通气,那么可用8层纱 布制成通气塞,有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.7 .包扎 加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸 ,以防灭 菌时冷凝水沾湿棉塞,假设培养基分装于试管中,那么应以5支或7支在一 起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好,然后用记号笔注明,培养基 名称,组别,日期.8 .灭菌 将上述培养基于121.3 C湿热灭菌20min,如因特殊情况不能 及时灭菌,那么应故入冰箱内暂存.9 .无菌检查 将灭菌的培养基放入 37c温箱中培养2448h,无菌生 长即可使用,或贮存于冰箱或清洁的橱内,备用.大肠杆菌的培养：37摄氏度,恒温培养48到72小时,由于接种时和具体培养条

8、件的 不同,其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落.菌落特征：乳白色,圆形,菌落边缘整洁,外表光滑,外表和反面颜 色一致.大肠杆菌/大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改进的培养 基,用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的 快速检测.大肠杆菌显蓝色至紫色,大肠菌群显红色.成份(g/L)特殊营养物质28.19混合显色剂0.31琼脂13.0pH 6.8 ± 0.2 25 C此配方可以进行改进或增加营养成份以获得最正确的结果.注息此培养基仅供实验室使用.用法称取本品41.5g参加1000ml蒸储水,加热溶解并不停搅拌,煮沸不要超过1分钟.取1ml制备好的样品液参加直径为

9、9cm无菌平 皿中央,倾入冷却至45-50 C培养基约15ml ,混匀,凝固后,再 参加一层培养基进行履盖.或冷却至 45-50 C时,倾入无菌平皿, 琼脂完全凝固后,在37 C的培养箱中倒置放置1-2小时,力口入适 当稀释度的样品液1ml ,涂布于培养基上,36 土 1 C培养1824h.贮存制备好的平板应立即使用,应预防光线直接照射.枯燥培养基应放置 于阴暗枯燥处, 保存温度2-8 C,注意避光保存.失效枯燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用.操作步骤1、按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液2、取样品液1ml参加 冷却至45-50 C显色培养基中混匀或 涂布于平板上

10、3、36 士 1 C培养1824h ,选用有30200个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群和大肠杆菌菌落. 大肠杆菌典型 菌落为蓝色至紫色,大肠菌群为粉红色菌落,其它细菌为无色或黄色 菌落.总大肠菌群=蓝色菌落+紫色菌落+粉红色菌落大肠杆菌=蓝色菌落+ 紫色菌落4、对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上, 36 ± 1 C 培养12-16小时,挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验 本公司有 生化鉴定管套装20支x3种质量限制1、外观此枯燥培养基的粉末均匀,具有良好的流动性,呈淡红色.制备好的 平板呈透明粉红色固体培养基.2、微生物试验在36 ± 1 C培养1824h小时：质控菌株ATCC生长情况菌落颜色单增李氏菌27853-/+无色金黄色葡萄球菌25923-/+无色大肠杆菌2592