(完整版)纤维素酶活力的测定

1、纤维素酶活力的测定1. 纤维素酶活力单位定义在 37 ,pH 值为 5.5 的条件下 , 每分钟从浓度为 4mg/ml 的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2. 测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖. 具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS 式剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比 , 而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比 . 因此 , 通过分光比色测定反应液颜色的强度, 可以计算反应液中纤维素酶的活力 .3. 试剂与溶液除特殊说明外, 所用的试剂均为分析纯, 水均为符合 GB/T

2、6682 中规定的三级水.3.1 葡糖糖溶液,c(C6H12O6) 为 10.0mg/ml:称取无水葡萄糖1.000g, 加水溶解 , 定容至 100ml.3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH历 0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml. 加水溶解 , 定容至 100ml.3.3 乙酸钠溶液，c(CH3COONa讷 0.1mol/L:称取三水乙酸钠 1.36g. 加水溶解 , 定容至 100ml.3.4 氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠 20.0g. 加水溶解 , 定容至 100ml.3.5 乙酸一一乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COO+ CH3COONa) 0.1mol/

3、L,pH 值为 5.5: 称取三水乙酸钠 23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解，定容至2000mL测定溶液的pH值. 如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠 (Sigma C5678)0.80g, 加入 80ml 乙酸乙乙酸钠缓冲溶液(3.5). 磁力搅拌 ,同时缓慢加热, 直至羧甲基纤维素钠完全溶解( 注 : 在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液, 但是溶液的总体积不能超过100ml.). 然后停止加热, 继续搅拌 30min, 用乙酸乙乙酸钠缓冲溶液 (3.5) 定容至

4、100ml. 羧甲基纤维素钠溶液能立即使用 , 使用前适当摇匀 .4 避光保存,有效期为 3 天 .3.7 DNS试剂称取 3,5- 二硝基水杨酸3.15g( 化学纯 ), 加水 500ml, 搅拌 5s, 水浴至45 . 然后逐步加入100ml 氢氧化钠溶液(3.4), 同时不断搅拌, 直到溶液清澈透明 (注意 : 在加入氢氧化钠过程中 ,溶液温度不要超过48 .). 再逐步加入四水酒石酸钾钠 91.0g, 苯酚 2.50g 和无水亚硫酸钠1.50 g. 继续45水浴加热, 同时补加水300ml, 不断搅拌 , 直到加入的物质完全溶解 . 停止加热, 冷却至室温后, 用水定容至1000ml.

5、 用烧结玻璃过滤器过滤 . 取滤液 , 储存在棕色瓶中 , 避光保存 . 室温下存放 7 天后可以使用 , 有效期为 6 个月 . 4 仪器与设备 4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵 . 4.2 分样筛 : 孔径为 0.25mm(60 目 ).1.51 分析天平 : 感量 0.001g.1.52 pH 计:精确至 0.01.1.53 磁力搅拌器: 附加热功能.1.54 电磁振荡器.1.55 烧结玻璃过滤器 : 孔径为 0.45m.1.56 离心机 :2000g 以上 .1.57 恒温水浴锅: 温度控制范围在30 60 之间, 精度为 0.1 .1.58 秒表 : 每小时误差不超过5s.1.59

6、分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围.1.60 移掖器 ; 精度为 1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温, 用水定容至25.0ml, 制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和 7.00ml, 分别用缓冲液(3.5)定容至 100ml, 配制成浓度为 0.10 0.70mg/ml 葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml( 做二个平行), 分别加入到刻度试管中 ,再分别加入2ml水和5mlDNS式剂(3.

7、7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到 室温，再用水定容至25mL以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度 OD值.以葡萄糖浓度为 丫轴，吸光度OD直为X轴，绘制标准曲线.每次新配制DNS式剂均需要重新绘 制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎, 然后过 60 目筛 ( 孔径为 0.25mm).称取试样两份, 精确至 0.001g. 加入 50ml 乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5). 磁力搅拌 30min, 再用缓冲溶液 (3.5) 定容至 100ml, 在4条件下避光保存24h. 摇匀 , 取出 30-50ml,2000g 离心3min. 吸取 5.0

8、0ml 上清液 , 再用缓冲溶液(3.5) 做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04 0.08 u/ml 之间 ).液体试样可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5) 进行稀释 , 定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在 0.04 0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶 液(3.2) 或乙酸钠溶液(3.3) 调节 , 校正至 5.5, 然后再用缓冲溶液(3.5) 做适当定容.7 测定步骤吸取 10.0ml 羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37 平衡 10min.吸取 10.0ml 经过适当稀释的酶液,37 平衡 10min.吸取2.00m

9、l经过适当稀释的酶液(已经过37 c平衡)，加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试 剂(3.7), 电磁振荡 3s. 然后加入 2.0ml 羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37 保温 30min, 沸水浴加热 5min. 用自来水冷却至室温, 加水定容至25ml, 电磁振荡 3s. 以标准空白样为空白对照 , 在540nm处测定吸光度 AB.吸取 2.0ml 经过适当稀释的酶液( 已经过 37平衡 ), 加入到刻度试管中 , 再加入 2.0ml 羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37c平衡)，电磁振荡3s,37 C精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂 (3.7), 电磁振荡 3s, 酶解反

10、应 . 沸水浴加热5min, 用自来水冷却至室温, 加水定容至25ml, 电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度 AE.8 . 试样酶活力的计算(AE - AB)XK + COXD = X 1000 (1) MK t式(1) 中:XD 试样稀释液中的纤维素酶活力 ,u/ml;AE 酶反应液的吸光度;AB 酶空白样的吸光度;K 标准曲线的斜率;CO 标准曲线的截距M 葡萄糖的分子量(180.2);t 酶解反应时间 ,min;1000 转化因子 ,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04 0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进

11、行分 析测定 .X = XD?Df (2)式(2) 中:X 试样纤维素酶的活力 ,u/g;Df 试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%, 二者的平均值为最终的酶活力测定值( 保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶（Novezymes 公司），0.0667 mol/L 的 KH2PO4-Na2HPO冲溶液（pH 值为 7.38 ;），月旨肪酸显色剂（5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2） ，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计， pH 计，水 / 油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。 2. 脂肪酸吸光度

12、工作曲线的绘制配制一系列不同浓度（1.5 , 2.5 , 3.5 , 4.5 , 5.5 , 6.5 , 7.5 , 10, 12.5 , 15 d mol/mL）的 油酸正己烷溶液，分别取5 mL于10 mL离心管中中，加入1 mL显色齐山磁力搅拌 3 min ,油酸分子与Cu2+生成绿色的络合物，离心后取上层有机相在714 nm处测定吸光度。用未加油酸的空白溶液作参比， 以吸光度对油酸浓度作图， 得一直线， 即为脂肪酸吸光度工作曲线。 3. 酶液的配置分别称取固定化酶0.1 g 左右溶于2 mL， pH=7.4 ， 0.0667 mol/L 的磷酸缓冲溶液中，振荡均匀， 40水浴预热待用。

13、 4. 酶活测定方法实验组：取3 mL.0.0667 mol/L磷酸盐缓冲溶液和 1mL橄榄油，放入超声仪恒温50 C超声10min,加入2 mL（含0.1 g酶制剂）酶溶液（先超声混匀 10min）,磁力搅拌15min, 立即加入1mL6 mol/L盐酸溶液和6 mL的95流水乙醇溶液，振荡2 min ,终止反应。分别加 入6 mL正己烷溶液萃取生成的脂肪酸。取上层有机相5 mL于10 mL离心管中，加入1mL显色剂，涡旋均匀后，产生的脂肪酸与Cu2+生成绿色络合物。静置离心10 min后，取上层含有脂肪酸铜的正己烷溶液，在 714 nm波长处测其吸光度。空白组：以相同方法制备不含脂肪酶的空白溶液为参比，