肽的人工合成ppt课件

1、 第六章第六章 肽的人工合成肽的人工合成前言前言20世纪初，世纪初，fischer 创建蛋白质的多肽构造学说创建蛋白质的多肽构造学说 1932年，年，Bergmann采用苄氧羰酰基作为氨基维护基采用苄氧羰酰基作为氨基维护基 同时期同时期Curtius创建酰氯法，叠氮法活化羧基的肽键生成法创建酰氯法，叠氮法活化羧基的肽键生成法50年代初，年代初，Wieland等开展了活化酯法和混合酸酐法等开展了活化酯法和混合酸酐法1953年，年，Vigneaud初次化学合成了多肽激素催产素初次化学合成了多肽激素催产素1963年，年，Schwyzer合成合成24aa的促肾上腺皮质激素的促肾上腺皮质激素(ACTH)

2、1965年，我国合成年，我国合成51aa的牛胰岛素的牛胰岛素1979年，矢岛治明液相法合成牛胰年，矢岛治明液相法合成牛胰RNaseA(124aa)80年代，年代，Merrifield提出固相合成法；多肽合成仪不断开展提出固相合成法；多肽合成仪不断开展第一节第一节 肽化学合成原理和液相合成肽化学合成原理和液相合成根本步骤：根本步骤： 1. -氨基和氨基和-羧基以及侧链的维护羧基以及侧链的维护 2. 羧基的活化和肽键的构成羧基的活化和肽键的构成 3. 脱除维护基和纯化脱除维护基和纯化 Z2 Z1 Z2 Z1XNHCHCOOH + H2NCHCOOY H2O XNHCHCO-NHCHCOOY Z3

3、Z2 Z1 脱维护脱维护 XNHCHCOOH + H2NCHCO-NHCHCOOY Z3 Z2 Z1 缩合缩合 XNHCHCO-NHCHCO-NHCHCOOY 维护基维护基全脱除全脱除 三肽三肽一一 氨基酸维护基氨基酸维护基 为了使肽键生成反响可以定向进展，需求对氨基酸的各为了使肽键生成反响可以定向进展，需求对氨基酸的各种官能团进展维护种官能团进展维护一一 -氨基维护基：氨基维护基： 常用：烷氧羰基、酰基和烷基常用：烷氧羰基、酰基和烷基基团结构基团结构名称名称脱除条件脱除条件苄氧羰酰基苄氧羰酰基（z）钯炭催化氢化法钯炭催化氢化法(H2/Pd) Na/液氨液氨, HF法等法等(CH3)3-CO-

4、CO-叔丁氧羰基叔丁氧羰基(Boc) 弱酸弱酸芴甲氧羰基芴甲氧羰基(Fmoc)碱脱除碱脱除: 20%呱啶呱啶/CH2Cl2-CH2O-CO- H CH2O-CO-二二 - -羧基维护基羧基维护基维护基种类相对较少维护基种类相对较少-羧基维护基种类：羧基维护基种类： 盐：钾盐、钠盐、三乙胺盐、三丁胺盐等盐：钾盐、钠盐、三乙胺盐、三丁胺盐等 盐是对羧基的暂时性维护盐是对羧基的暂时性维护 酯：甲酯和乙酯、苄酯、叔丁酯酯：甲酯和乙酯、苄酯、叔丁酯(最常用最常用三侧链的维护：三侧链的维护：20种种aa中有中有13种侧链需求维护种侧链需求维护Lys-NH2 和侧链羧基和侧链羧基:选择与选择与-氨基和羧基不

5、同的维护氨基和羧基不同的维护基基 Cys-SH: 甲基苄基、对氧苄基等三氟乙酸铊甲基苄基、对氧苄基等三氟乙酸铊/ TFA脱除脱除)羟基羟基aa(Ser,Thr,Tyr)：苄基、叔丁基：苄基、叔丁基酰胺基维护：酰胺基维护：2,4,6-三甲氧苄基等可用三甲氧苄基等可用TFA脱除脱除二二 肽键生成法肽键生成法根本思绪：使根本思绪：使-羧基活化为羧基活化为RCOX方式，加强羰基方式，加强羰基碳原子的正电性，便于碳原子的正电性，便于-氨基进展亲和攻击而成肽氨基进展亲和攻击而成肽一活化酯法：一活化酯法：方法：方法： 采用巯基、烷基、酚基和采用巯基、烷基、酚基和N-羟胺类物质最羟胺类物质最常用：常用：N,N

6、-二环乙基碳二亚胺，二环乙基碳二亚胺，DCC)与与N-维护维护aa作作用，使用，使-羧基活化为酯的方式，然后进展成肽反响。羧基活化为酯的方式，然后进展成肽反响。优点：优点： 中间产物可以分别、结晶、保管，便于去除副产中间产物可以分别、结晶、保管，便于去除副产物物 氨基组分的末端羧基可以不维护氨基组分的末端羧基可以不维护 对酰胺基活化特别有效对酰胺基活化特别有效二二 缩合剂法：缩合剂法：重要的缩合剂：重要的缩合剂：DCC, DIC(二异丙基二异丙基DCC等等DCC接肽反响机理：接肽反响机理：-N=C=N-R-COOH-NH-C=N- OCOR-NH-CO-NH-N,N-二环己基脲二环己基脲DCU

7、RCO-NH-R +H2N-RR-COOH+ (R-CO)2O 对称酸酐对称酸酐O-酰基脲酰基脲H2N-RDCC-NH-CO-NH- 三三 叠氮法：叠氮法：是最古老的经典肽键生成法是最古老的经典肽键生成法(1902年，该法最少引起消旋年，该法最少引起消旋 O O O R-C-OCH3 H2NNH2 R-C-NHNH2 R NO2 R-C-N3 酰化氨基酸酰肼酰化氨基酸酰肼 酰化氨基酸叠氮酰化氨基酸叠氮 O H2N-R R-C-NH-R + 碱碱 HN3 碱碱 四混合酸酐法：四混合酸酐法：50年代提出，简单、反响快、纯度好，尤其适宜小年代提出，简单、反响快、纯度好，尤其适宜小肽合成肽合成 R1

8、R1 Z-NH-CH-COOH 叔胺叔胺(Et3N) Z-NH-CH-COO- Et3+NH R1 O O RO-COCl Z-NH-CH-C-O-C-OR H2N-R2 成肽存在副成肽存在副反响反响三三 脱维护基及纯化脱维护基及纯化一一TFA法：法：方法：将产物置于三氟乙酸方法：将产物置于三氟乙酸(TFA)中处置，以脱中处置，以脱除维护基除维护基优点：用于脱除一些不耐酸的维护基，温暖，优点：用于脱除一些不耐酸的维护基，温暖，副反响少，尤其适宜于固相合成法。曾用于副反响少，尤其适宜于固相合成法。曾用于胰高血糖素合成。胰高血糖素合成。缺陷：缺陷：TFA用量较大，需维护的氨基酸种类较用量较大，需维

9、护的氨基酸种类较多等多等二二HF法：法：方法：以无水氟化氢方法：以无水氟化氢(HF) 在在0 20C处置处置3060min优点：可脱除其他方法难以脱除的维护基，比优点：可脱除其他方法难以脱除的维护基，比TFA法有效法有效缺陷：缺陷： HF腐蚀性强，脱除时副反响较多腐蚀性强，脱除时副反响较多三含硅试剂法、有机磺酸法等三含硅试剂法、有机磺酸法等四四 二硫键的生成二硫键的生成是蛋白质合成中最困难的任务是蛋白质合成中最困难的任务经典方法：空气氧化法、碘氧化法，收率低，副反响严重经典方法：空气氧化法、碘氧化法，收率低，副反响严重目前目前: 三氟乙酸铊三氟乙酸铊 (CF3COO)3Tl 法：法： 可先裂解

10、可先裂解Cys的各种维护基，然后金属铊作为弱氧化剂的各种维护基，然后金属铊作为弱氧化剂催化二硫键的生成，效率是碘氧化法的催化二硫键的生成，效率是碘氧化法的2倍倍 亚砜介导法亚砜介导法sulfoxid-directed): Cys亚砜和亚砜和CysR在酸处置下，生成的在酸处置下，生成的SH作用于亚砜的作用于亚砜的S原子，在亚砜位置处生成二硫键。用不同的原子，在亚砜位置处生成二硫键。用不同的Cys亚砜和酸处亚砜和酸处置，可在需求的位置定点生成二硫键。置，可在需求的位置定点生成二硫键。五五 合成肽的纯化和纯度鉴定合成肽的纯化和纯度鉴定纯化：凝胶过滤、离子交换层析、反向纯化：凝胶过滤、离子交换层析、反

11、向HPLC等等鉴定：薄层层析、等电点聚焦、分析鉴定：薄层层析、等电点聚焦、分析HPLC、质、质谱法谱法 等等六六 肽的液相法合成战略与例如：肽的液相法合成战略与例如：小肽合成：逐渐延伸法小肽合成：逐渐延伸法(stepwise elongation)，从，从C-端开场端开场 逐一合成，使肽链向逐一合成，使肽链向N末端延伸的方法末端延伸的方法大肽合成：片段缩合法大肽合成：片段缩合法(fragment condensation) ，先分段，先分段 合成小肽再缩合成大肽段，缩合时常用不易消旋合成小肽再缩合成大肽段，缩合时常用不易消旋 的叠氮法的叠氮法片段缩合法战略：片段缩合法战略： 划分肽段：长度普通

12、不超越划分肽段：长度普通不超越10个个aa残基残基 尽能够以不易消旋的尽能够以不易消旋的Gly、Pro等为肽的等为肽的C-端端 aa和维护基性质对肽段纯化难异的影响和维护基性质对肽段纯化难异的影响 构象要素影响构象要素影响 选择接肽顺序：小片段分头缩和选择接肽顺序：小片段分头缩和大片段大片段肽肽 (有时很难或不能进展有时很难或不能进展) 小片段逐一缩合小片段逐一缩合(反响步骤多但产率高反响步骤多但产率高) 较大片段逐一缩合常用较大片段逐一缩合常用) 例如：牛胰例如：牛胰RNase ARNase A124aa124aa的合成的合成将将RNase A分生长短不一分生长短不一30个片段，分别以逐渐延

13、伸法合成个片段，分别以逐渐延伸法合成从肽的从肽的C-端开场，用叠氮法小片段依次接肽，得到维护的端开场，用叠氮法小片段依次接肽，得到维护的RNase AN-端为端为Z(苄氧酰基苄氧酰基)；C-端，端，OBzl(苄氧基苄氧基) Cys(对甲氧苄基，对甲氧苄基，Mbzl) 和和Met亚砜的复原，得到复原型维护亚砜的复原，得到复原型维护的的RNase A1mol/L三氟甲磺酸三氟甲磺酸/TFA脱维护；巯基乙醇脱维护；巯基乙醇 + 二硫苏糖醇；二硫苏糖醇； 过过Sephadex G-25层析柱，得到去维护基的层析柱，得到去维护基的RNase A 在谷胱苷肽存在下空气氧化构成二硫键，在谷胱苷肽存在下空气氧

14、化构成二硫键，Sephadex G-25，得到合成的，得到合成的RNase A 粗品粗品(活力活力18.9%)经过亲和层析，产物活力经过亲和层析，产物活力81.3%CM-纤维素层析，得到离子交换层析纯产物纤维素层析，得到离子交换层析纯产物95%乙醇处置，得到牛胰乙醇处置，得到牛胰RNase A结晶，酶活力结晶，酶活力100%第二节第二节 固相肽合成固相肽合成一、合成原理：一、合成原理： 1963年，年，Merrifield将将aa的的C-端固定在不溶端固定在不溶性树脂上，然性树脂上，然 后在其上依次进展氨基后在其上依次进展氨基酸缩合，延伸肽链。抑制了液相合成法酸缩合，延伸肽链。抑制了液相合成法

15、中每一步产物纯化的困难，奠定了自动中每一步产物纯化的困难，奠定了自动化肽合成的根底，化肽合成的根底， 为此，为此，Merrifield于于1984年获得年获得Nobel化学奖化学奖固相法合成较之液相法简单、快速，不固相法合成较之液相法简单、快速，不需每步纯化中间物需每步纯化中间物 固相法适宜固相法适宜1030aa的小肽，不流失的小肽，不流失 但固相法合成肽的纯度差，大肽或高但固相法合成肽的纯度差，大肽或高纯、大量小肽合成采用液相法纯、大量小肽合成采用液相法一一Boc固相法经典固相法经典Merrifield法法): 因氨基维护基采用可用因氨基维护基采用可用TFA脱除的脱除的Boc而而得名得名;

16、侧链用苄醇类维护；侧链用苄醇类维护； 树脂为氯甲基化或羟甲基化聚苯乙烯树脂为氯甲基化或羟甲基化聚苯乙烯,对乙酰氨基苄酯树脂对乙酰氨基苄酯树脂方法：方法： Boc-NH-CHR1-COO- + Cl- CH2-树脂树脂 C-末端末端aa与树脂结合：与树脂结合： Boc-NH-CHR1-COO-CH2-树脂树脂 用用TFA法脱除法脱除N-Boc CF3COO- - +NH3-CHR1-COO-CH2-树脂树脂 三乙胺中和、洗涤三乙胺中和、洗涤 NH2-CHR1-COO-CH2-树脂树脂 在在DCC存在下与存在下与Boc-aa耦联，洗涤耦联，洗涤 Boc-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-COO

17、-CH2-树脂树脂 脱维护、反复接肽脱维护、反复接肽 Boc-NH-CHRn-CO- -NH-CHR1-COO-CH2-树脂树脂 全部维护基脱除，全部维护基脱除，HF法等法等 目的肽目的肽二二Fmoc固相合成法：固相合成法： Fmoc固相合成法的步骤与固相合成法的步骤与Boc固相合成法类似固相合成法类似不同之处：不同之处： 氨基维护基为：可用碱氨基维护基为：可用碱(20%呱啶呱啶)脱除的芴甲氧羰基脱除的芴甲氧羰基(Fmoc), 侧链维护基为：可以用侧链维护基为：可以用TFA脱除的叔丁基脱除的叔丁基 树脂：采用树脂：采用90% TFA可切断的烷氧苄醇型可切断的烷氧苄醇型 或或1% TFA可切断的

18、二烷氧苄醇型可切断的二烷氧苄醇型优点：防止最终的强酸处置优点：防止最终的强酸处置二、二、 自动肽合成仪：自动肽合成仪：1966年，年，Merrifield等报道了最初的自动肽合成仪等报道了最初的自动肽合成仪普通以普通以Boc或或Fmoc固相合成法为根底，将肽合成自动化固相合成法为根底，将肽合成自动化监测：监测： Fmoc有明显的紫外吸收有明显的紫外吸收第三节第三节 酶促肽合成和半合成酶促肽合成和半合成一、根本原理：一、根本原理： 利用蛋白水解酶催化肽键的构成利用蛋白水解酶催化肽键的构成优点：反响条件温暖；不引起优点：反响条件温暖；不引起aa消旋；消旋； 不要求不要求aa侧链维护；副产物少，侧链

19、维护；副产物少，后处置较简单后处置较简单1. 酶促合成多肽的酶类：酶促合成多肽的酶类：主要有四类：主要有四类：Ser蛋白水解酶；蛋白水解酶；HS-蛋白水蛋白水解酶；解酶； 羧肽酶；羧肽酶； 金属蛋白酶类金属蛋白酶类2. 对对aa成分的选择：为使反响向肽键生成成分的选择：为使反响向肽键生成方向进展方向进展二二 酶合成反响的几个系统：酶合成反响的几个系统：为了使反响定向进展，将参与反响的氨基组分的羧基端和羧为了使反响定向进展，将参与反响的氨基组分的羧基端和羧基组分的氨基端维护基组分的氨基端维护为提高合成反响效率，防止二次水解，创建一些特定的反响为提高合成反响效率，防止二次水解，创建一些特定的反响系

20、统，如：系统，如：1. 沉淀系统：降低产物溶解度，使其沉淀，防止水解沉淀系统：降低产物溶解度，使其沉淀，防止水解 如：如：Z-Phe-COOH + Z-Leu-NH2 Z-Phe-Leu-NH2 在凝乳酶在凝乳酶(200mol/L)催化下，催化下，PH7反响反响20hr，收率为，收率为70 80%。随反响进展溶液逐渐变褐色，黏稠化、最终完全固化。随反响进展溶液逐渐变褐色，黏稠化、最终完全固化2. 二相系统：将缓冲液与有机溶剂搅拌成乳浊液二相系统，二相系统：将缓冲液与有机溶剂搅拌成乳浊液二相系统，水相普通占水相普通占25%，底物和酶在水的悬滴中反响，但生成的，底物和酶在水的悬滴中反响，但生成的产物为脂溶性的。随着反响地进展，产物自动转移至有机相产物为脂溶性的。随着反响地进展，产物自动转移至有机相中，不再与酶接触。如：中，不再与酶接触。如： Z-Glu-COOH + Ala-ODPM Z-Glu- Ala-ODPM(二苯甲酯二苯甲酯)三三 酶促半合成酶促半合成 ：对于无维护的大肽段的之间的定向衔接，无法