NDM基因的检测与确认

1、NDM-1简介 一个新发现的耐药基因，全长826bp 编码1型新德里金属-内酰胺酶 造细菌成对碳青酶烯类药物耐药 位于质粒上 最初发现在肺炎克雷伯杆质粒pKpANDM-1上 Genbank FN396876 （2009.11.24） 具有可移动性 可在不同种属细菌间转移 革兰阴性：肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌 革兰阳性：？ E.coli Genbank AB571289 （2010.07.10）NDM-1的基因检测1.PCR检测2.序列测定最终确认检测对象：已经过表型筛检的菌株进行NDM-1基因确认对大批菌株直接进行筛检对标本的检测高通量、快速、准确PCR检测方法模板制备模板制备：菌株、标本1

2、.菌株（1）G-细菌： a. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200l纯水 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清，-20 保存 b. 试剂盒提取基因组DNA（说明书）PCR检测方法模板制备1.菌株（2）G+细菌： a. 试剂盒提取基因组DNA（说明书） 溶菌酶充分作用 b. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200 l纯水 低温反复冻融（-40 以下或液氮） 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清，-20 保存2. 标本：根据标本类型不同选择相应的试剂盒PCR检测引物选择1. 引物选择：扩增片段位于CDS正向的191-482位置（反向345-

3、636位置） 483-769位置（反向58-344位置）引物特异性较好，理论上无非特异扩增片段引物引物引物序列（引物序列（5 3）产物大小（产物大小（bp）退火温度退火温度()引物引物117U-191CAGCACACTTCCTATCTC2925517L-465CCGCAACCATCCCCTCTT引物引物2F-58GGCGGAATGGCTCATCACGA28660R-344CGCAACACAGCCTGACTTTCPCR检测PCR体系 引物合成稀释 冻干粉末，开启前10000rpm离心5min 小心开盖，防止粉末喷出 1.0OD+268 l纯水，充分震荡混匀 ，浓度20 M（20 mol/L） 2

4、0 l体系（右图）若使用含有Mg2+的10buffer的加入量同上表，MgCl2体积用水补齐 PCR Premix预混液（根据说明书）成分成分体积（体积（l l）1010bufferbuffer2 2dNTP dNTP （10mM each10mM each）1.61.6MgClMgCl2 2 （2.5mM2.5mM）1.21.2Primer-FPrimer-F（2020 MM）1 1Primei-RPrimei-R（2020 MM）1 1TaqTaq（5U/l5U/l）0.20.2纯水纯水1212DNADNA1ng1ng总体积总体积2020PCR检测PCR体系 没有阳性对照，如何确保体系正常

5、运转 同批 配置体系时：增加1管不使用NDM-1引物 加入常用引物及模板，扩增其他已知片段 人工合成长片段DNA作为阳性对照？ 不建议合成：首次发现时如何排除“污染”质疑 如果一定要合成：在中间区域加入若干数量的突变位点 作为区别合成片段与实际阳性片段的标志PCR检测PCR反应条件与电泳 反应条件：（约耗时1小时25分钟）94 5min94 15secTm 30sec 25个循环72 30sec72 5min 电泳：1.5%琼脂糖电泳 marker：DL2000基因序列测定最终确认PCR阳性结果：携带NDM-1基因 非特异扩增最终确认：序列测定测序公司，当天得到结果测序样品：100 l以上PC

6、R产物引物及其浓度：上下游引物各10 l（20uM）测序要求：双向、测通，提供拼接好的序列 基因序列测定测序结果判读 测序彩图：峰体清晰、无套峰基因序列测定测序结果判读 双向测序结果拼接起始段结果（10-30bp）、反应结果段结果（500bp）不可用基因序列测定序列比对 下载参考序列： Genbank：FN396876.1 /nuccore/255031061 AB571289、HQ171206、HM853678 将测度序列与参考序列比对： 常用软件：Clustal、DNAstar、Mega最终确认是否为NDM-1基因序列判定该细菌携带NDM

7、-1基因NDM-1基因携带与耐药 抗生素敏感性细菌表型特征 耐药基因正确表达，表现出细菌的抗生素敏感性 一种细菌可具有多种耐药机制 NDM-1只是其中一种 该细菌表现出的抗生素敏感性是各种耐药机制综合表现的结果 NDM-1基因的检测与确认基于基因水平的判断 菌株A携带NDM-1基因 菌株A的耐药谱，NDM-1基因对于这株菌的作用 具体问题具体分析谢谢大家！NDM-1的基因检测1.PCR检测2.序列测定最终确认检测对象：已经过表型筛检的菌株进行NDM-1基因确认对大批菌株直接进行筛检对标本的检测高通量、快速、准确基因序列测定测序结果判读 双向测序结果拼接起始段结果（10-30bp）、反应结果段结果（500bp）不可用基因序列测定序列比对 下载参考序列： Genbank：FN396876.1 /