实验二溶血空斑

1、n溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验方法，经典的试验是用于胞的一种体外试验方法，经典的试验是用于检查动物的抗体产生功能。检查动物的抗体产生功能。【试剂与器材试剂与器材】1. 1. 健康小鼠（约健康小鼠（约181820 20 克重）。克重）。2. 2. 绵羊红细胞悬液（绵羊红细胞悬液（2.5%2.5%）。）。3. 3. 指示细胞悬液：指示细胞悬液： 含含10% 10% 绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液 0.5ml0.5ml，补体（即新鲜豚鼠血清），补体（即新鲜豚鼠血清

2、）0.3ml0.3ml， Hanks Hanks 液液2.0ml2.0ml。4. Hanks 4. Hanks 液（液（pH7.2pH7.2）。）。5. 5. 动物解剖器械、注射器（动物解剖器械、注射器（5ml5ml）、平皿、中）、平皿、中 试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、6. 6. 盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。【操作方法操作方法】n免疫动物n取2.5% 绵羊红细胞悬液2ml，无菌操作注射于小鼠腹腔内。（4 天后追加一次免疫效果更佳）。制备脾细胞悬液制备脾细胞悬液1.1.将免疫后将免疫后7 7 天的小鼠颈椎脱位

3、处死，天的小鼠颈椎脱位处死，左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用5ml 5ml 的注射器的注射器抽取平皿内液体抽取平皿内液体(4(4ml)ml)缓缓注入脾脏内，将脾细缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。5.5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用少量用少量Hanks Hanks 液冲洗脾脏及平皿内残留的液冲洗脾脏及平皿内残留的细胞，移入试管内。离心细胞，移入试管内。离心1000 1000 转转/ /分分5 5 10 10 分分, , 弃上清，加弃上清，加5

4、ml 5ml 冷红细胞裂解液（冷红细胞裂解液（NHNH4 4Cl Cl 3.735g/450ml 3.735g/450ml 双蒸水双蒸水+Tris 1.3g/50ml +Tris 1.3g/50ml 双蒸双蒸水水pH7.65pH7.65），将细胞离心管插入碎冰中，每），将细胞离心管插入碎冰中，每2 2 分钟摇动分钟摇动1 1 次，裂解次，裂解10 10 分。离心（分。离心（10001000转转/ /分）分）5 510 10 分。弃上清，用分。弃上清，用Hanks Hanks 液洗液洗2 2 次，离心（次，离心（1000 1000 转转/ /分）分）5 51010分钟。弃上清。分钟。弃上清。6.

5、6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸取此悬液吸取此悬液0.1ml 0.1ml 放小试管中，再加放小试管中，再加0.9mlHanks 0.9mlHanks 液，即为液，即为500 500 倍稀释的脾细胞倍稀释的脾细胞悬液。悬液。ABDC1mm1mm1ml=1cm3=1000mm3细胞数细胞数=A+B+C+D4 104 稀释倍数稀释倍数Concentration/ml = (Dilution Factor)(Count in 4 squares/4) X 104细胞数细胞数=A+B+C+D4 104 稀释倍数稀释倍数Concentration/ml =

6、 (Dilution Factor)(Count in 5 squares X5)X 104玻片小室的制作玻片小室的制作取洁净的载玻片按下图贴二条宽约取洁净的载玻片按下图贴二条宽约5mm 5mm 和一条和一条10mm 10mm 的双面胶，然后用小镊子取的双面胶，然后用小镊子取二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。细胞混悬液的配制及灌注细胞混悬液的配制及灌注1.1.取小试管一支，用取小试管一支，用1ml1ml吸管取吸管取0.2ml0.2ml指示指示细胞悬液；细胞悬液；0.2ml 5000.2ml 5

7、00倍稀释的脾细胞倍稀释的脾细胞悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。2.2.用用100l100l的微量进样器吸取被检细胞混的微量进样器吸取被检细胞混合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两个小室。记录实际注入的悬液微升数。个小室。记录实际注入的悬液微升数。3. 3. 将做好的标本水平放置将做好的标本水平放置3737温箱中，温箱中，孵育孵育30 30 分。分。【结果分析结果分析】结果观察及溶血空斑计数。结果观察及溶血空斑计数。1.1.肉眼观察空斑肉眼观察空斑 ，计数两个小室出现的溶血空，计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑，可在低倍镜下检斑数。对模糊不清的空斑，可在低倍镜下检查。真正的溶血空斑，必须中心有一个淋巴查。真正的溶血空斑，必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。细胞，周围为透明区。2.2.计算出全脾脏中