细胞增殖凋亡检测方法总结

1、细胞增殖凋亡检测方法总结作者:日期:细胞增殖、凋亡-检测方法汇总1.直接计数法3面单粗暴，傻瓜式的检鲂法！利用计数板成计数仪得出细胞数目,然后对数目进行比较。三方注惠要讨不同时间点的细胞分别固定，而后在；民下计数.可绘制出细胞生长曲线。而其 不足之处在于无法区分墙遭细胞与非增殖唯胞，不适合样品数量客和评估特定亚群的情况,H-TdR渗人法A.CH3也存在放射性核素也是DNA告成的必需物质.用同位素3厢记TdR即如/TdR作为口NA合成的前体渗入DNA合成代朗过程.通过液体闪烁计数器可测定细胞的放射 性强度，间接放映出细胞增殖情况,4该方法优点在于敏感性高.君观性强.董聂性好 污染问题.3. Br

2、du/EdU检测法Bdu&EdU均是胸除嗑嘘的衍生物r均可代普胸淳嗑嘘在DNA合成期掺入亚胞中心不同的是Bdu检测法可利用Bdu专一性抗体和其他细胞标记物对细咆遂行双重染色r可判断 增殖细胞的种类及增殖速度.不仅适用于体外实验也能用于活体实验。这个方法最大的缺点需 要变性DMA才能与抗体结合，破坏了口NA双链结构,导致染色弥散、准确性降低等问题口EdU检测法则基于Ed U与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性r适用于细胞增殖，细 胞标记示踪等方面的研究.尤其适合进行siRNA miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实 验. EUU检测染料只有BdU抗体大小的1为00,在

3、细胞内很容易就扩散，无需DNA变性.9BrdU与EdU检测优缺点综合比较BrdU检测分子检测方式影响其他标记DNA变性实验时间检测灵敏度大免疫反应是需要过夜一般很小化学反应否不需要2.5小时 灵敏MTT检测法反映钿胞的能量代谢,是检测汨胞增殖活力的一种简便准确方法。其原理是在活细胞生长和增殖过程中,麦粒体内的脱氧酶可将黄色的MTT分解为蓝紫色的水不溶性的甲璜(Formazan ),并沉积在细胞中死细胞无此功能，DMSO溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联 检测仪在490nm波长处检测其光密度值,可间接反映活细胞数量0CCK8是MTT的升皴板1CCK-8细胞活性检测试剂中含有WST-8 ( MTT的类

4、似物)，在电子据 合试剂存在的情况下.可被线粒体中的脱氢酶还原成橙黄色的甲瑞(Formazan ),用酶联检窝仅在450nm波长处检测其光密度值,可间接反映活细胞数量, 细胞增殖越快,则颜色越深：细胞毒性越大,则颜色越浅.CCK-8 法或 WST-8 法还原后的Formazan是水溶性的（不需要溶解）MTT法还.原后的Fcrmazan是水溶性的（需要加有机溶剂溶解）重现性好操作简便弃上清附，会损失小部分的Formazan,故重复性略差操作繁琐测定波长：450490nm壬;瓦长：490ocOniji1瓶溶液，无需预制，即开即用 需加有机溶剂溶解，工作量大因此CFSE9将细胞悬液力0A等体积的CF

5、SE工作液,37乙孵育10nlin用40%体积的冷小牛血清立即经止标记CFSE是一种可穿透细胞瞳的荧光染料.可逆的与纸胞内8 良好的细胞怀记物.当细胞分期，CFSE标记荧光可平士 黄光强度呈对运口递减,可利用流式细胞仪对其进行分析6.核抗原Ki67染色法20Kr67是目前较为肯定的核增惹标志物，它只叁与增殖细胞核反应，其表达噜强是细胞有缝分 裂，增殖活性增强的一个可靠标记.研究表明Kr67的表达墟可盘而迅速的反应恶性肿瘤的增值 率.IKi 67几苧在所为鬓 里的3群有友达. 通博任州电周期的活 KNk M a 幅 M )可以检测划.9S TTlkBH (GD)恰好 不到二.细胞增殖一旦过度，就

6、有可能形成肿瘤。为了维持机体的健康，细胞走向凋亡。现将细胞凋亡的检测方法介绍给大家一形态学检测L通过光学显糊费或剧置显微傥现察细胞形念.1）天染色细胞周亡细胞的体积变小，变形，姗胞膜完整但出现发泡现象，班胞凋亡厥期可见周亡小住，贴壁 强造出琉验箱、变国、脱落a ViableApoptctk2）染色细胞常用吉姆萨染色、瑞氏染醇,相亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块 状和凋亡小体等典型的凋亡形态:Giemsa staining f姆第染液天仃色泰，伊红, 次甲蓝的泥冷液）喘氏Wright1 s stainf矣蓝一伊红形态学特征:0唠漉亡小体2.通过荧光显微院和其聚焦激光扫描显微镜

7、观宸细胞形态以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况口该法中常用的DNA特异性染 料有:Hoechst 33342. Hoechst 33258.DAPL三秫染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合 在DNA的A-T碱基区°紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光,细胞凋亡中细胞核染色质的形态学改变分为三期：I期的细胞核呈波纹状或折缝样,部分染色质 出现浓缩状态；II日期细胞核的染色后高度潦聚, 边缘化；II b期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡 小体必contrtilstaj>e stayc IEuslayc libDAPI 4，.-1叶上曲ELIV”，柿鎏也侬的整Hsch

8、找是与DNA特异牯合的泡性 始料.储存液用熊储水制成 lEg/El的浓度I使用时用PBS稀得 成弊浓度为NfoiRrnlDAPI为半通透性.用于常规固定细 胞的证色.储存液川德询水配成 工,力引的液戈使用终法废一股 为口,53.通过透射电子显徽镜观察细胞形点凋亡细胞体积变小,表面减绒毛消失，细胞质浓缩 凋亡I期(pro-apoplosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现讦多称为气穴现象的空泡结构；II日期细胞核的3伊帝高母三足、西再化；细胞凋亡的晚期J细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体,controlstage Hapro*apoptosis nuclei u»n国2电f显

9、徵犍。出Jurlw肉胞阳亡过史中 1117 t m I式二产冠泊心Nh变二 Annexin V/PI 染色周亡细胞的细幅表面的改变之一是St魔StMSfi ( PS )从细炮膜内虻移到细胞眼外，隹PS暴星 在烟胞月更处表面.Annexin V黑一种Ca琳赖的磷脂结合者日,对PS有高度的亲和性.PI (碘化丙1« )是一种对 DNA染色的细胞核染色试剂.在嵌人由DN/后降放红色荧光.尽管P1不能通过活量跑膜,但却 能穿过破损的钿胞膜而对核染色.M；喧内味 中制制i«tvtr jii »i / «；crm三DNA的片段化凋匚细胞UNA断裂点均有规律的方生在核

10、小体之间,出现180200bpDNA片段.而西死细肥生DNABff裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征工以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别.hrm W C*rMlM gM MA)Lt*w DM世 HgpCNME 睛 werw1a«M iri! - nl IM hasd& *v4 !>5 *四Tun包检测法细胞凋亡中，染色体DMAJR链或单链断裂而产生大鼻的粘性3 -0H末端,可在脱氧核推檀昔酸末 嫌转移询(TtfT )的作用下，格脱氧核糖核昔窗荧光素、过葡化物的一gifflB或生物素形 成的衍生物标记到3：0H末温，从而可进行凋亡期据的检测.MONMALAF0W5K

11、一 一一 一，JFI- 1T . 一UwUnU4Ml 皿必4 DNAFt卡4m! tMAIE“NO五线粒体膜由位篁粒体在细胞凋亡中起着抠纽作用，线粒体跨月髓位的下降，被认为是细胞踞亡级隙反应过程 中最早发生的事件，一旦浅粒体质溃,则细胞墙亡不而逆林.因而，线粒体跨原电位的存在，使一些亲瞪®楠子荧光染料如Rhodamine123、JC-t TMRM等可接合到线粒体基质，其荧光的噌强或痫马说明线粒体内膜电负性沟增高或降低。方法：符正宜培葬的用孑逐导凋亡细胞加入筌浓度为Rhod自mine建3 ( 1mM ). JC- 1 (1mM), TMRM (10DnM) . 3了工平衡30min ,

12、流式细胞检测细胞的荧光慢度。27原理；JC7染料在正常细胞内聚集在线 粒体内.影成多聚体,发红色荧光；而在 凋亡细胞内.由于线粒体溟电位的破坏， 不能聚集到斑粒体内，以单体的形式存在 于胞质内发螺色荧光口Flow tvtom电trie analysis of iurkat cells the MHoProb< JC-1 Aay Kit. Jurkat cel Is were stained with 2 uM JC-1 for 15 m：n at 37 & 5% CO2, tnd th«nwithphoiphflte<buffar«d ulint (PB

13、S) «nd inilvzad on a Flew cytOTuttr u审ng 438 nm excitton with 530 he and 53S nm bandpass amission filters. (A) Ufitr«at«d cu turad c«Hi- (B) 31k induced m apopiq口帛 wrth 10 jjM camntothecin for 4 hr at 37 C.A酬胞包索C轻放Apoptolic bignahH Pbr«rcki*tien肚辘中璃M c从魏体向更质悔制 址曹靖用I匕鸣制加国苗导6小

14、时一 QCfhrmiK- l Ar闭向3 Amy Kil（/台瑞号： 已用100网月1接因纥以分M景额朝），热后 一的诲饱色气玳飞的一岭廊的|由，能就 "t麒麟班艇赧也 晦触偏Cytoi徜吸七Caspase活性检测C弟p日能家播在凋亡信号转导的许多途径中发挥功能，n乎p不必3正常浴原 3?kP ） E勺形式点在于痼堡中 在凋亡早期阶段被黜舌.活化的 Ca叩as»3由两个大亚基（17kD ）和两个小亚篁 12kD ）细成，裂解相应的胞浆胞核底物.最 线导致细胞谑亡，但在邳胞凋亡的晚明和死亡地胞,e&sp白583的活性明显下降.A凋亡相关单白粒测 促凋亡分子Ba* BcbXsr Bak, Bad, Bid,川£Apaf-l等 抑制凋亡分子Bd2. Bcl-XL f!lbcr/abl kinase '/J 相关信号通路分了检测抗凋亡信