高级生化课件全

1、高级生物化学（生化分离与分析技术或生物化学研究技术）研究生的特点：“研究” 专一性、系统性。各学科研究的共性：机理的研究(物质基础蛋白质)，通过机理的研究，使研究者由 一叶障目 不见泰山 一叶知秋(蛋白质种类与含量的变化)。恩格斯曾说:"生命是蛋白体的存在方式,这种存在方式本质上就在于蛋白质化学成分的不断自我更新." 这就是说:没有蛋白质的存在,也就没有生命。100多年前, 恩格斯提出“蛋白体” 是生命运动的物质承担者, 由此就产生了“生命是蛋白体的存在方式” 这一生命定义；恩格斯所指的蛋白体其实是以蛋白质为主体的, 包括各种与代谢活动有关的生物分子的有机组合体。即生物体。

2、并不是现在的单纯蛋白质。本课程的主要内容：沉淀技术、离心技术(常与沉淀技术结合使用)、层析（色谱）技术、电泳技术、免疫化学技术(与亲和层析有重叠)、酶分析技术、同位素示踪技术、蛋白质与核酸的序列分析技术。以蛋白质为主线（因为还有基因工程原理课）。生物化学与分子生物学研究技术：生物化学与分子生物学研究技术是研究生物大分子最基本、最重要的技术之一，是生命科学发展过程中必不可少的重要组成部分。生物化学与分子生物学研究技术都是以生物大分子为研究对象，是目前在生物大分子水平上研究的最常用技术。生物化学研究技术是以蛋白质研究技术为主，介绍一些相关生物化学技术如：光谱技术、色谱技术、蛋白质电泳技术、蛋白质测

3、序技术、超离心技术等。分子生物学研究技术是以核酸化学为主介绍一些相关的研究技术：如基因构件、分子克隆、DNA测序、核酸电泳等技术。从基因工程或蛋白质工程的角度说分子生物学研究技术称之为基因工程上游技术，生物化学研究技术称之为基因工程下游技术。前者具有一定的共性，后者具有一定的个性特点。但是从广义上来说许多技术的原理都是相同的，只是在实际应用中各有侧重。生物工程下游技术：泛指从工程菌或工程细胞的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量监测所需要的一系列操作技术。其中产品的分离纯化是最重要的部分。主要包括离心、沉淀、膜分离、色谱分离、电泳分离等。目标产品蛋白质的分析检测：1. 蛋白质的含量与纯度；2.

4、 氨基酸分析（组成种类、排列顺序）；3. 蛋白质的分子量测定； 4. 等电点；5. 肽谱分析（结合裂解方法）；6. 蛋白质的突变点分析(酶)； 7. 二硫键分析；8. 序列测定；9. 蛋白质翻译后修饰的分析。随着蛋白质组计划的展开，下游技术显得越来越重要，以致多数用人单位要求熟悉“色谱技术等下游技术”本课程采用讨论式 欢迎大家提出问题、积极参与讨论！参考书目1赵永芳编著，生物化学技术原理及其应用，武汉大学出版社，1995年7月第二版2 （美）C.W.迪芬巴赫等著，黄培堂等译，PCR技术实验指南，科学出版社，1998年8月第一版，1999年4月第二次印刷3（美）F.奥斯伯等著，颜子颖等译，精编分

5、子生物学实验指南，科学出版社，1998年6月第一版4杨安钢、毛积芳、药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年2月第1版5. 陈毓荃主编，生物化学实验方法和技术，科学出版社，2002年8月第一版学知识与应用：不谋全局者，不足谋一域；不谋万世者，不足谋一时。学习的动力：有人说求名计利：计利当计天下利，求名应求万世名学习的态度：水惟善下方成海，山不矜高自极天待人：反观自己难全是，细论人家未尽非对钱：事能知足心常惬，人到无求品自高烦恼：欲除烦恼须无我，历尽艰难好做人交友：友如作画须求淡，文似看山不喜平学习内容：世事洞明皆学问，人情练达即文章做事：欲除天下不平事，方显人间大丈

6、夫前序：要从生物体内获得某一组分进行分析与研究，首先要确定取样对象及其部位！一、取样的原则1、 取样的代表性：代表研究对象的本质，从自然群体或待研究的群体中取样；样本量小于30份为小样本，大于30则为大样本；研究病例时，可能只有一个样本，难于总结出规律(只能对症医治) 2、 部位：表现研究特征与本质的部位，越精细越好，如：表现特征的部位，缺锌的叶主脉两侧、缺钙的根尖、茎尖等停长坏死。研究癌细胞就要从癌组织中取样。细胞分化常常从某一个细胞或几个细胞开始，所以取样要精细，才能有针对性。二、提取与分离或制备样品分子1. 生化分离分为分离分析与分离制备，分离分析即分离各组分，而进行定量与定性鉴定，不一

7、定把某组分从混合物中分离提取出来，如，氨基酸的定性与定量分析。分离制备则是为获得某一单纯组分。并有活性或生理功能，这与其结构有关，所以，生化分离与化学分离不同，要保证其结构和性质不改变。有如下特点： 成分复杂且时刻在发生代谢变化。 有的含量很少，用材料多。如，激素、酶等。 离开活体易变性，所以条件要温和，且低温 使代谢减慢不变质。 都在溶液中进行，影响因素多，要重复性好，就必须严格规定材料、方法、条件与试剂等。 均一性鉴定需多种方法：层析、电泳、染料显色、理化特性分析等。故生化分离与制备大都根据混合物中不同组分分配率的差别（顺其自然，先试验再总结规律，用于实践），将它们分配于可用机械方法分离的

8、两个或几个物相中（如有机溶剂抽提油脂、盐析、结晶等沉淀分离蛋白），或将混合物置于某一物相中（多是液相），外加一定的作用力，使各组分分配于不同区域而分离（如电泳、超离心、超滤等）。先介绍溶剂提取、沉淀、膜分离、浓缩与干燥。现代生化分离制备常用沉淀、离心、层析、电泳四大技术。第一节 溶剂提取法利用溶剂的溶解作用，从细胞中提取所需物质，这里影响物质溶解度即影响提取的因素主要有：1溶质的性质：如，DNA、RNA易溶于盐溶液中【DNA提取缓冲液（500mM NaCl、100 mMTris·HCl、50mM EDTA）】，微溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质中清蛋白：溶于水与稀盐溶液；球蛋白不溶于水

9、，溶于稀盐；谷蛋白可溶于稀酸稀碱，但不溶于水2溶剂的性质，相似相溶原理（极性）。 酸、碱互溶机制：碱性物质易溶于酸性溶剂中，反之亦然；极性溶剂中，溶解极性物质，溶剂的介电常数减小一些溶质的溶解度就减小。可通过丙酮等沉淀一些蛋白。3离子强度：I=1/2CZ2 （Z：离子价数，C：离子的摩尔浓度）高盐中DNA溶解度大，低离子强度下RNA溶解度大，0.14mol/LNaCl 中可溶出RNA而沉淀DNA(一般以2mol/L氯化钠溶解)。蛋白质在稀盐中，比水中溶解度大，称为盐溶效应，此乃少量离子的活动，减少了蛋白质分子极性基团之间的静电引力，加强了蛋白质与溶剂间的相互作用之故。低盐还可稳定一些物质的生理

10、活性，所以生化物质多用之提取。4pH：溶剂的pH值影响溶质的解离状态，离子态易溶于水，分子态则易溶于有机溶剂，酸性物质在低pH下或碱性物质在高pH下均可转溶于有机溶剂，两性物质在等电点之外，均成离子态，所以AA一般不用有机溶剂提取。Pr、酶等还要考虑pH对其活性的影响，一般控制在pH68左右，避免过酸、过碱。5温度：高温时溶解度增大，但易变性，绝大多数生物大分子，提取温度选在010，避免变性。6去够剂（双亲物质）：具有乳化、分散和增溶作用；有阴、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂有Tween20、40、60、80（聚氧乙烯（20）山梨醇酐单油酸酯），Triton X-100（非离子型系列

11、去污剂的商品名 为聚乙二醇辛基苯基醚）等，对蛋白质和酶的变性影响较小，宜用于蛋白质与酶的提取，常用的阴离子去垢剂SDS(十二烷基硫酸钠)可促进核蛋白的解体（使蛋白变性），释放出核酸，并抑制核酸酶，所以，常用于核酸的提取。 提取酶等的新鲜材料的储存：保鲜的最佳方法是冷冻贮藏：冰壶、冰袋、冰箱、冷藏库等。组织细胞内蛋白质的提取：组织细胞的破碎： 研磨法：研钵等需预冷，磨料石英沙等要洗净消毒（幼嫩组织可不加）；以预冷的水或缓冲液抽提。渗透压法：动植物组织在04下，用20%蔗糖的缓冲液处理12h而后转入无蔗糖的水或缓冲液内，使细胞破裂。突然吸水胀破！多用于动物细胞和幼嫩的植物细胞（成熟的壁厚不易破）自

12、溶法：自溶法是在一定的pH和适当的温度下,利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法.自溶法所需时间较长,常添加少量防腐剂如甲苯,氯仿等防止细菌的污染.酶解法：以溶菌酶（破坏糖苷键，属单纯蛋白质）破壁，多与EDTA（抑制其他酶）结合使用。如细菌DNA提取，加EDTA可抑制核酸酶活性。冻融法：-20下冻结，让冰晶（4时体积最小）破坏细胞（可先吸水）。并可保持酶活性。如动物酶的提取。超声波法：超声波的空化作用，使不同部位产生压力差，迫使细胞破碎，此法适于悬浮样品。超声波破碎作用基本原理：超声波在媒质中传播可使媒质质点在其传播空间内进入振动状态强化溶质扩散，即超声波机械机制。超声波在媒质质点传播过程

13、中其能量不断被媒质质点吸收变成热能，导致媒质质点温度升高，即超声波热学机制。同时当大能量的超声波作用于提取介质，在振动处于稀疏状态时，介质被撕裂成许多小空穴（气泡，空化是液体内局部压力降低时，液体内部或液固交界面上蒸气或气体的空穴（空泡）的形成、发展和溃灭的过程），这些小空穴瞬时即闭合，闭合时产生高达几千大气压的瞬时压力，即空化现象。超声法输入高能超声波可以破碎细胞，其机理与超声波作用溶液时的气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞裂解。超声波破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等。超声波破碎在处理少量样品时操作简便,效率高,液量损失少,适于实

14、验室使用。但应注意的是超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活,另外噪声比较大。匀浆器法：使细胞在高压摩擦下破裂或通过微孔而被挤破。经过以上步骤将细胞中的组分集中溶在溶剂中。如何分离？第二节 沉淀法（分离）用于浓缩、纯化、利于保存方法有：盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、非离子多聚体沉淀法、生成盐复合物沉淀法、加热及酸碱变性沉淀法和专一性沉淀法。1盐析法：盐溶与盐析蛋白质胶体只在某一特定的低盐浓度下溶解度最大，少量离子可减少蛋白质分子极性基团之间的静电引力，加强蛋白质与溶剂之间的作用力（同时减弱蛋白质分子间的引力）盐溶；但盐浓度增大到一定程度时，会破坏蛋白质表面的水化膜、并中

15、和掉其表面的电荷，进而使蛋白质分子之间相互聚集而沉淀盐析。所以可用盐沉淀。影响蛋白质盐析的因素：蛋白质浓度：太浓易出现共沉淀，太稀时盐的消耗量太大，蛋白质回收率也低。以2.53.0%较好（含量测定）。蛋白质制备前期，保持一定的pH和温度而改变盐浓度，后期分离纯化，则保持一定的盐浓度而改变pH和温度（微调）。离子强度与类型：各离子与蛋白质分子间争夺水分子，破坏其水和膜，使蛋白质溶解度减小而沉淀，离子浓度越大，越易盐析沉淀。不同蛋白质所需的离子强度不同，所以可分步盐析。离子半径越小，价数越高的离子（吸水能力强）盐析作用越强，所以，不同离子沉淀能力不同。pH：影响蛋白质所带电荷，蛋白质所带静电荷越多

16、，溶解度越大，等电点时溶解度最小。所以盐析时可调节pH到pI(左右)。温度：要求不严格，一般用低温，可防止蛋白质变性而丧失生理活性。同时，低温时多数蛋白的溶解度低；不需活性的可用热变性沉淀。 如，硫酸铵盐析法：各种中性盐均可，但硫酸铵价格便宜，溶解度大，且其溶解度受温度变化影响小，但因含氮，对蛋白质分析有影响(弊)。用时要注意：1. 保证纯度，可重结晶后再用(去除重金属离子)，其溶液成酸性，要用氨水(不要用NaOH)或H2SO4(不用HCl)调成所需的pH。（防氨蒸发和Cl离子污染）2. 硫酸铵的饱和度及其调整法：饱和状态时的饱和度为100%，不同饱和度的调整：通常硫酸铵的添加以百分饱和度来表

17、示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在 80% 硫酸铵饱和度下沉淀。 因为硫酸铵加入的体积很大，会改变最后的体积，很难由浓度百分比来计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。 加入固体盐法：要求饱和度高又不增大溶液体积时用(样品少时)。要磨细，在搅拌下、缓慢加入，各种分离分析技术工具书中均有附表，可按此加入。硫酸铵的饱和度亦可直接加入固体硫酸铵调节，其加入量可按下式计算：x=G(S2-S1)/(1-AS2) 其由来：x+1*S1G = (1+xB)*S2G = S2G+ S2GxB令B*G=A则x+S1G = S2G+A S2x x(1-AS2) = S2G-S1G x=G(S2-S

18、1)/(1-AS2) 式中X是将1升饱和度为S1的溶液提高到饱和度为S2时所需硫酸铵的重量（g），G（由饱和度转化为重量的系数 均值）及A（B为将重量x换算为体积的常数）为常数，与温度有关。G在0时为488.34，20时为533；A在0时为0.356，20时为0.29。G在25时为541，A在25时应为0.31. 调整硫酸铵溶液饱和度计算表（ 25 ）硫酸铵终浓度 ,%饱和度 （25）10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100 每 1升溶液加固体硫酸铵的克数 硫 酸铵 初 浓 度 ， % 饱和 度 0 56 114 144 176 1

19、96 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767 10 57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 694 20 29 59 78 91 123 155 190 225 262 300 340 382 424 520 619 25 30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 583 30 19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 546 33 12 43 74 107 142

20、 177 214 252 292 333 426 522 35 31 63 94 129 164 200 238 178 319 411 506 40 31 63 97 132 168 205 245 285 375 469 45 32 65 99 134 171 210 250 339 431 50 33 66 101 137 176 214 302 392 55 33 67 103 141 179 264 353 60 34 69 105 143 227 314 65 34 70 107 190 275 70 35 72 153 237 75 36 115 198 80 77 157 90

21、 79 指在 25 下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每升溶液所加固体硫酸铵的克数。2. 调整硫酸铵溶液饱和度计算表（ 0 ）在 0 硫酸铵终浓度 ,% 饱和度 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 每 100毫升溶液加固体硫酸铵的克数 硫 酸铵 初 浓 度 ， % 饱和 度 0 10.6 13.4 16.4 19.4 22.6 25.8 29.1 32.6 36.1 39.8 43.6 47.6 51.6 55.9 60.3 65.0 69.7 5 7.9 10.8 13.7 16.6 19.7 22.9 26.2 29.6

22、 33.1 36.8 40.5 44.4 48.4 52.6 57.0 61.5 66.2 10 5.3 8.1 10.9 13.9 16.9 20.0 23.3 26.6 30.1 33.7 37.4 41.2 45.2 49.3 53.6 58.1 62.7 15 2.6 5.4 8.2 11.1 14.1 17.2 20.4 23.7 27.1 30.6 .4.3 38.1 42.0 46.0 50.3 54.7 59.2 20 0 2.7 5.5 8.3 11.3 14.3 17.5 20.7 24.1 27.6 31.2 34.9 38.7 42.7 46.9 51.2 55.7 2

23、5 0 2.7 5.6 8.4 11.5 14.6 17.9 21.1 24.2 28.0 31.7 35.5 39.5 43.6 47.8 52.2 30 0 2.8 5.6 8.6 11.7 14.8 18.1 21.4 24.9 28.5 32.3 36.2 40.2 44.5 48.8 35 0 2.8 5.7 8.7 11.8 15.1 18.4 21.8 25.4 29.1 32.9 36.9 41.0 45.3 40 0 2.9 5.8 8.9 12.0 15.3 18.7 22.2 25.8 29.6 33.5 37.6 41.8 45 0 2.9 5.9 9.0 12.3 1

24、5.6 19.0 22.6 26.3 30.2 34.2 38.3 50 0 3.0 6.0 9.2 12.5 15.9 19.4 23.0 26.8 30.8 34.8 55 0 3.0 6.1 9.3 12.7 16.1 19.7 23.5 27.3 31.3 60 0 3.1 6.2 9.5 12.9 16.4 20.1 23.1 27.9 65 0 3.1 6.3 9.7 13.2 16.8 20.5 34.4 70 0 3.2 6.5 9.9 13.4 17.1 20.9 75 0 3.2 6.6 10.1 13.7 17.4 80 0 3.3 6.7 10.3 13.9 85 0

25、3.4 6.8 10.5 90 0 3.4 7.0 95 0 3.5 100 0 指在 0 下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每 100 毫升溶液所加固体硫酸铵的克数。 加入饱和溶液法:V=V0(S2-S1)/(1-S2) S1、2分别为调整前后的饱和度因为：V0×S1V×1=(V0+V)*S2 V0*S2+V*S2= V0×S1V×1 V×1- V*S2= V0*S2-V0*S1 V=V0(S2-S1)/(1-S2) 透析平衡法：将待透析的样品溶液装入透析袋中，浸入饱和硫酸铵溶液中进行透析(反向)，使外部的硫酸铵靠扩散作用不断进入透析袋中，

26、逐步达到所需的盐析饱和度，使蛋白质沉淀，此时停止透析。因硫酸铵浓度变化是连续的，所以盐析效果较好，多用于蛋白质的结晶。注意问题：1.加入硫酸铵（固液）时要在搅拌中缓慢加入，以免局部浓度过高造成共沉淀影响分离。分不开各段都有。研究时尽量不用，而用加入饱和溶液的方法。2.要保证盐析条件的稳定性，如pH、温度及硫酸铵的纯度等。摸索条件，以后备用，也作为蛋白的一个特性。3.盐析后要放置0.5-1小时，待沉淀完全后再分离(沉淀需要过程)（离心或过滤），以免影响回收率。4.分离沉淀时，低浓度硫酸铵溶液用离心分离，高浓度时则用过滤，因为此时需要较高的离心速度与时间，所以不如过滤快。如：超氧化物歧化酶(SOD

27、)的分段分离 蚯蚓SOD主要在70-80%硫酸铵饱和液的沉淀中。杂质中有共沉淀的SOD.测定及纯化需透析除盐。二、有机溶剂沉淀法降低溶液的介电常数（束缚电荷的能力），增加溶质分子间的相互作用，使溶解度减小，同时还有破坏溶质分子表面水化膜的作用，使大分子溶质脱水而相互集聚析出。V=V0(S2-S1)/(S3-S2) S3：表示需要加入的有机溶剂的浓度。S1、S2分别表示原浓度和所要达到的浓度。有机溶剂沉淀法比盐析法分辨能力高，且不用脱盐，易于过滤；但易引起生物大分子变性，常需在低温下操作。最常用的是乙醇、丙酮等。样品浓度要适宜，过浓易引起共沉淀(近饱和时)和溶质变性，过稀回收率低；此外，pH值、

28、离子强度与种类也应使溶质的溶解度最低才好。三、等电点沉淀法：在等电点时，两性电解质的净电荷为零，这样的物质分子在溶液中因为没有相同电荷而相互排斥的影响，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，而沉淀析出，所以这时最不稳定，溶解度最小。不同的两性电解质因pI不同，故可用之分离，如氨基酸、蛋白质（酪蛋白）、核苷酸等，常与盐析、有机溶剂沉淀等一起使用，提高沉淀效果。四、非离子多聚物沉淀法： 如PEG(聚乙二醇)、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠(右旋糖酐 系葡萄糖组成的多糖, 右旋糖酐硫酸钠是带有电荷的葡聚多糖)、聚丙烯酰胺干凝胶等，通过空间位置排斥使溶液中的溶质颗粒被挤在一起而引起沉淀，此法不易引起生物大分子

29、变性，同时沉淀效能高，沉淀后多聚物易于除去，所以多用于核酸、蛋白质及酶的沉淀分离，有两种操作方法：1.用两种非离子多聚物，组成液液两相系统(互不相溶的)，使生物大分子在两相中不等量分配而分离，如可用葡聚糖和聚乙二醇为两相系统分离单链DNA、双链DNA和多种RNA制剂；在20世纪六十年代，聚乙二醇开始用于蛋白质纯化，其分子量多在2000-6000之间变化，多数认为PEG6000沉淀蛋白较好。右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物也常用于蛋白质沉淀中。2.用一种非离子多聚物，构成液相系统，使生物大分子在其中因被排斥而积聚沉淀（用不同浓度）。多用后者。五、其它沉淀法：表面活性剂变性、有机溶剂变性、热变

30、性、酸、碱变性沉淀法等。如，蛋白尿的鉴定。第三节 膜分离技术（人为的）用一定孔径的分离膜用于生物大分子的脱盐、浓缩与提纯，主要根据各种溶质分子的大小、形状及性质的差异，对于不同孔径的滤膜有不同的通透性，滤膜有选择性的让小分子通过，而挡住大分子(象筛子)；分子透过膜的动力有：简单扩散、膜两侧的流体压力差或电压差，由此衍生出透析、超滤、反渗透、电渗析(膜分离技术之一，直流电只提供动力)等。一、透析：1.原理：根据溶质分子的大小利用膜两侧存在的小分子浓度差进行分离。2.影响因素：膜的通透性即膜孔径的大小，能阻碍大分子扩散时，孔径越大透析越快。要选透析外液的更换速度：因透析过程中小分子不断向外扩散逐渐

31、达到平衡。所以不断更换透析外液或对流水透析，以维持膜两侧的浓度差，可加快透析速度。 温度：温度高可使溶液黏度下降分子运动加快，故可提高透析速度。但易使生物大分子变性，所以一般在低温下进行。压力：增加膜两侧的压差，可加快透析速度。如将透析袋放在真空系统中，不断提高真空系统的真空度（减压），亦可加压过滤（微孔过滤、超滤和反渗透）。溶剂：蒸馏水扩散速度最快，分子又小，易进入透析袋内，使透析溶液浓度下降，所以常将透析袋装满，另外，在纯水中透析易出现杜南平衡（蛋白质带电荷吸附反离子，使膜内、外溶液pH升高或降低可扩散离子亦出现浓度不平衡，只是电荷平衡），引起生物大分子变性。故一般对缓冲溶液进行透析。如：

32、血液透析（人工肾）所用的膜：有纤维素膜、纤维素衍生膜和合成膜三种。  纤维素膜是将天然纤维溶解、再生后制成再生纤维素和纤维素衍生物。 纤维素衍生膜有醋酸纤维素膜、血仿膜。  合成膜是高分子聚合物,生物相容性好,常用的有聚丙烯氰膜(PAN)、聚甲基丙烯酸甲酯膜(PMMA)、乙烯基乙烯醇共聚膜(E-,VAL)、聚砜膜(PS)、聚酰胺膜(PA)、聚酯聚合物合金膜,(PEPA)。  血液透析所使用的半透膜厚度为1020微米，膜上的孔径平均为3纳米，所以只允许分子量为1.5万以下的小分子和部分中等大小的分子通过，而分子量大于3.5万的大分子物质

33、不能通过。因此，蛋白质、致热源、病毒、细菌以及血细胞等都是不可透出的；尿的成分中大部分是水，要想用人工肾替代肾脏就必须从血液中排出大量的水分，人工肾只能利用渗透压和超滤压来达到清除过多的水分之目的。现在所使用的人工肾即血液透析装置都具备上述这些功能，从而对血液的质和量进行调节，使之近于生理状态。血液透析的透析液从生理学考虑, 需要有以下几个功能能维护恒定的溶质清除率; 补充患者缺乏的物质(如钙离子、氨基酸、营养物质); 能纠正酸中毒pH为生理性。因透析液具备调节体液的水-电解质平衡等作用 透析液处方的基本要求： 电解质的组成和浓度与正常血浆相近; 渗透压一般不低于血浆渗透压; 根据病情适当地加

34、入药物，如抗生素、肝素等。 故血液透析的透析液最接近于血浆，才能形成平衡作用3.透析袋的处理与保存处理：为了去掉膜上可能带有的金属离子，防止大分子失活，一般将透析袋在碱性EDTA溶液（Na2CO3 10g/L、EDTA 1mmol/L）中煮沸30分钟，然后用蒸馏水洗净。(碱性使EDTA带负电螯合能力增大)保存：用过的透析袋最好浸泡在含有微量苯甲酸钠（抑菌剂）的溶液里，以防长霉。二、超滤：是加压膜分离技术，分离原理似过滤；一般以氮气加压或在超滤液另一侧抽气产生负压（抽滤），按所加操作压及所用滤膜的孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。超滤均在密闭容器中进行。微孔过滤：所用操作压在5磅/平

35、方英寸以下（合0.35大气压以下），膜孔径为500埃至14微米。1磅/平方英寸0.07kg/cm2(即大气压)=6894.8Pa；1atm=100000Pa。超滤：所用操作压在5100磅/平方英寸（合0.357大气压），膜孔径为10至100埃。反渗透：用于分离小分子物质，所用操作压在5002000磅/平方英寸（合35140.6大气压），膜孔径在10埃以下。如，现代的海水淡化主要用之分离水和其中溶解的离子。即反渗透所用操作压应在35个大气压以上！（与渗透水流方向正好相反，通过加压）常用的反渗透膜有三种：醋酸纤维素膜，芳香聚酰胺膜（似尼龙）和复合膜。反渗透膜几乎可以适应任何进水水质，但其对进水处理

36、要求很严格，要求进水的主要水质指标为污染指数，其值应小于5。第五节 浓缩与干燥一、浓缩：除去水或溶剂，蒸发、离子交换吸附(溶质)、沉淀、萃取、亲和层析等均可，这里只介绍吸收浓缩与膜浓缩： 吸收浓缩：加入吸收剂从溶液中吸收水或溶剂，吸收剂应具有不与溶液反应、不吸附溶质、易与溶质分离，除去溶剂后可重新利用等特性，常用的有：聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺干凝胶等（非离子多聚物）。通过空间位置排斥，浓缩前后pH无变化。 膜浓缩： 低渗透析：在多聚物的低渗溶液中进行透析（分离物放于纤维素膜制成的透析袋中），水或溶剂透出被多聚物吸收，常用的吸收多聚物有：聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇及葡聚糖

37、等（吸收剂可对分离物吸附时加膜），缺点是多聚物中有杂质时易污染。 其他膜浓缩：减压透析、离心（超滤离心管）、加压超滤等均可。二、干燥：除尽水或溶剂的过程，在生化研究中，最重要的干燥方法是真空干燥与冰冻干燥。 真空干燥：即减压干燥，有利于保持活性。 冰冻干燥：将溶液冷冻成固体然后在低温、低压下使之升华留下干物质。制取物成粉末状，极易溶于水，用途较广。冷冻干燥机分离技术领域：新型生化分离技术    研究内容：    1、超临界CO2分离技术的应用    2、膜分离、亲和色谱等新型

38、分离技术在天然产物有效成分的提取与分离、生物技术产品的纯化分离中的应用 超临界CO2萃取技术、分子蒸馏技术、超重力场技术是目前国际上较新的三大提取分离技术、采用这些技术对中药进行提取分离纯化，对实现中药现代化具有重要意义。超临界流体（Supercritical Fluid,简称SF或SCF）是指超临界温度（Tc）和临界压力（Pc）状态下的高密度流体。超临界流体具有气体和液体的双重特性，其粘度与气体相似，但扩散系数比液体大得多，其密度和液体相近。超临界流体对物质进行溶解和分离的过程就叫超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extracti

39、on,简称SFE）。其基本原理为：CO2的临界温度（Tc）和临界压力（Pc）分别为31.05和7.38MPa，当处于这个临界点以上时，此时的CO2同时具有气体和液体双重特性。它既近似于气体，粘度与气体相近；又近似于液体，密度与液体相近（密度大粘度小），但其扩散系数却比液体大得多。是一个优良的溶剂，能通过分子间的相互作用和扩散作用将许多物质溶解。同时，在稍高于临界点的区域内，压力稍有变化，即引起其密度的很大变化，从而引起溶解度的较大变化。因此，超临界CO2可以从基体中将物质溶解出来，形成超临界CO2负载相，然后降低载气的压力或升高温度，超临界CO2的溶解度降低，这些物质就沉淀出来（解析）与CO2

40、分离，从而达到提取分离的目的。不同的物质由于在CO2中的溶解度不同或同一物质在不同的压力和温度下溶解状况不同，使这种提取分离过程具有较高的选择性。通过摸索不同温度和压力下不同物质在超临界CO2中的溶解度，可用此方法提取之！分子蒸馏技术 分子蒸馏是一种特殊的液-液分离技术，它不同于通常的沸腾过程，更确切地的说，它应称为"分子蒸发".在二十世纪六七十年代，发达国家已经将分子蒸馏技术成功地应用于天然产物分离领域。分子蒸馏过程是在高真空条件下（系统压力只有0.1Pa）进行的连续分离过程，它不仅利用混合物组分之间的相对挥发度，还充分利用组分之间分子量的差异，因此其分离能力比常规的蒸馏

41、和精馏有显著的提高，可以对一些常规分离技术难以实现的分离物系进行分离。分子蒸馏过程对产品的收集采用不同的冷却系统，最后一级是采用液氮深冷，因此对沸点较低组分的损失可以减小到最低程度。 分子蒸馏技术是天然产物提取、纯化的先进共性关键技术，可用于中药原料生产过程的提取和纯化。分子蒸馏是一种特殊的液-液分离技术，它不同于传统蒸馏依靠沸点差分离原理，而是靠不同物质分子运动平均自由程的差别实现分离。当液体混合物沿加热板流动并被加热，轻、重分子会逸出液面而进入气相，由于轻、重分子的自由程不同，因此，不同物质的分子从液面逸出后移动距离不同，若能恰当地设置一块冷凝板，则轻分子达到冷凝板被冷凝排出，而重分子达不

42、到冷凝板沿混合液排出。这样，达到物质分离的目的。它已在化工、轻工、制药（西药） 领域实现了产业化，并且受到广泛重视和应用。分子蒸馏在中药原料分离过程具有其它传统分离方法难以达到的优势：分离效率高、分离温度低，对热敏性物料的损失可以降到最低程度；同时分离过程不需要任何有机溶剂，是绿色分离工艺。超重力作用就是离心力场的作用，在强大的离心力场中物质的相对运动加快，不同物相的反应加快（强化）第二章 离心 离心是最重要的分离技术之一，是完全的物理方法分离技术，它既不使样品受到污染，也不易使样品变性，所以是一种较为理想的分离方法。第一节 离心技术的基本原理与设备一、沉降原理悬浮液中的颗粒在重力场中的沉降速

43、度，受沉降过程中的摩擦力F1与浮力F2（等于重力）的双重作用， F1=6rpdr/dt （即受到的阻力） F2=(p -m)V*g （重力）（衣塔）:介质的黏度 rp ：颗粒半径 dr/dt：沉降速率 p ，m：分别是颗粒和介质的密度 V：颗粒体积g:重力加速度（不同场所有别）当颗粒匀速沉降时，F1=F2，即6rpdr/dt= (p -m)V*g 球形颗粒的体积V=4/3·rp3 6rpdr/dt=4/3·rp3(p -m)g dr/dt=2rp2(p -m)g/9当沉降是在强大的离心力场中进行时，颗粒沉降的离心加速度2r比重力加速度g大得多，此时沉降速度(由离心加速度2r

44、的方向和大小所决定)：即dr/dt=2 rp2(p -m)2r /9，当颗粒与介质的性质确定之后，沉降速度主要取决于离心加速度2r的大小，即与离心机转速和颗粒离转轴中心的距离有关。一般以相对离心力（与所受重力的比值）表示颗粒在离心力场中所受到的离心力：RCF= F离/F重=2r/g (因为F离=2rm ；F重=mg)。角速度不便测量，它与离心机每分钟转数(rpm)有如下关系： = 2rpm/60=rpm/30（弧度/秒）所以:RCF=(rpm/30)2r/g=2rpm2r/900g=1.119×10-5rpm2r（因为g=9.8m/s2=980cm/s2）（=3.14159，2/90

45、0g=1.119×10-5）RCF的大小以重力加速度g的倍数表示。所以知道了离心机的每分钟转数和转头半径即可计算相对离心力（RCF）。也可由RCF和r求出所需rpm。离心机转头说明书上一般标明半径大小（最大r与最小r），不予说明时一般指平均离心力。只说明每分转数是不明确的，RCF=1,r=10cm时，rpm=94.5转/分，即离心半径为10厘米，每分钟94.5转的转速所产生的离心力即相当于物体受到的重力。讨论： 颗粒匀速沉降只是假设 无法保证离心力与阻力相等，因为受到离心力的作用，应进行匀加速运动， 物体受到一定的力作用，将进行匀加速运动，物体受到外力作用时，会改变物体的运动状态，产

46、生加速度，只有不受外力作用时，静止的物体则会一直静止，运动的物体，则会做匀速直线运动。 实际远比这要复杂！肯定产生加速度的。只是简化研究而已。二、沉降系数S沉降速度与离心力场成正比，这一比例常数就是沉降系数Sdr/dt=2 rp2(p -m)g/9：重力作用下的自然沉降 离心时颗粒、介质均固定为常量，沉降速度只与2r有关，故可写成：dr/dt=S*2r S= dr/dt/2r是单位离心加速度下的沉降速度，称为沉降系数。单位应为秒(根据概念为cm.s-1/cm.s-2=s,因为离心加速度一般很大，所得值很小，所以一般以10-13秒为单位，称斯维伯格单位)。1S=10-13秒 可用来描述生物大分子

47、，亚细胞结构的大小，如16SRNA、28SRNA、80S核糖体等（同密度下，颗粒越大，沉降速度越快），测定如下：S=ln（r2/r1）/2*（t2-t1）=2.303*lg（r2/r1）/2*（t2-t1） =2*rpm/60 =2.1*100* lg（r2/r1）/（rpm）2*（t2-t1） 得到的单位是秒。注：t2-t1是消逝时间（秒）r1，r2是离心起始和终了时颗粒与转轴中心的距离rpm是每分钟转数亦可根据S=dr/dt/2r 直接用分析型超速离心机测定(因为dr/dt可测知，按平均速度计；r用离心过的平均半径，2r离心机及转子可提供)。三、离心设备1. 离心机按转速高低可分为三种类型

48、： 低速离心机2000-6000rpm，最大离心力为6000g。一般只有驱动和速度控制系统。 高速离心机10000-25000rpm，最大离心力达60000g。一般备有冷却装置，有的还有真空系统。一般配有角度转头、水平转头、垂直转头等。超速离心机转速在40000转/分钟以上，最大离心力可达600000g。可分为分析型、制备型和分析制备型。分离主要用制备型的。超速离心机主要有三大系统：驱动和速度控制系统、温度控制系统和真空系统。一般都配有多种不同容量和性能的转头（1.5ml*24，50ml*8,50ml*10,500ml*4），可供选择，有微处理机可按使用者编定的程序重复运转而无差错。RCF、离

49、心速度、时间及2r均由电脑自动计算和显示。2. 转头（转子）：离心机的转头一般有角度转头、垂直转头和水平转头三种，角度转头：最常用。是离心管腔与转轴中心所成角度在14-40度之间。角度转头一般用于样品的差速离心，从大容量的样品中收集或去掉沉淀。垂直转头：垂直转头是离心管腔与转轴中心所成角度0度而与水平面垂直。可用于差速离心（距离小 快）和等密度梯度离心（自生密度梯度）。水平转头：由转头和吊桶（篮）两部分组成，离心前吊桶处于与水平面垂直位置，加速后被甩成水平位置，因为它有长距离的特点，所以产生的液体对流比角度转头和垂直转头要少的多，因此很适合于密度梯度离心。注意事项：1.每个转头都有一定的使用限

50、度，即运转次数和运转时间。达到限度(运转时间)后，再使用它其最大额定速度应降低10% ，二次超限使用时应再降低10% ，所以每个转头必须单独建档，记录使用时间和使用次数。一般每年减10%，直到60%为止。我们生化室的为4年。2.最大额定转速是有条件的，若条件不符，应按下式计算：最大允许转速=最大额定转速*SQRT（WA/WB）注：WA是指注满了比重为1.2溶液的塑料离心管重量+硬铝帽的重量，WB是操作时所用离心管重量+管帽重量+样品溶液重量。离心管或样品液重，则最大允许转速就小。3.离心管及其管帽：是转头的重要附件，按质地可分为：玻璃、塑料和不锈钢。管口有螺口和光口两类。玻璃离心管：只能用于低

51、速离心。除水平转头外，角度转头和垂直转头中所用的离心管离心时都要加盖管帽，作用有二：防止样品液外溢造成腐蚀或污染离心腔；防止离心管变形。第二节 制备超离心方法制备超离心技术主要包括：差速离心法和密度梯度离心法一、差速离心法差速离心法又叫分级离心法：为了分出某一组分，需要进行一系列离心，先选择一个离心速度和离心时间，把大部分不需要的大的颗粒沉降去掉，再把上清液用更高的速度离心，把需要的粒子沉降下来。再用更高的离心速度离心上清液，沉降需要的更小的粒子。若不纯，则用相同的介质把沉淀悬浮起来，再用较低的速度离心即可去掉沉淀中混杂的较小粒子。是基于各种粒子的沉降速度不同对其进行分离的。操作较简单。但有如

52、下缺点： 要得到某一组分，需要时间长，效率低。 一次只能得到沉降最快的组分。 颗粒大小相差过小时，难于用此法分离。二、密度梯度离心将样品粒子在一个密度梯度介质中离心，此介质由一合适的小分子及其溶剂组成，离心时，离轴心越远介质的密度越大。比差速离心法分辨力高，可同时分离样品中的几个或全部组分。按操作方法的不同，又可分为：梯度介质制备装置A低浓度液；B高浓度液；C电磁搅拌器；D，E活塞；F搅拌磁棒；G离心管 3. 离心过程中自动形成的，如 硫酸铯、氯化铯等，蔗糖也可但需较长时间。 速率区带离心：离心过程中颗粒常受到振动、温差和对流的干扰。因此，要利用密度梯度来消除和减轻这种现象。分离样品的最小密度

53、要大于介质的最大密度，因样品中的各组分沉降速率不同，被分离成一系列的样品区带，所以称速率区带离心。这里密度梯度介质的作用是： 支撑样品溶液， 防止离心中产生的对流对已形成区带的破坏作用（下面密度大的介质不会上浮）。但密度梯度介质的最大密度不能超过待分离粒子的最小密度。否则不能有效分离，所以离心时间不能过长，否则更多组分都将沉降下来，而达不到分离的目的。同时此法因样品容量的限制，故不适于大量制备实验。此种分离主要取决于粒子之间所受离心力与摩擦阻力的差异。 等密度梯度离心：介质的密度梯度范围包括待分离的样品中所有颗粒的密度。各粒子移动到与其密度相等的地方即形成区带所以叫等密度梯度离心。此种分离主要取决于粒子之间的密度差。梯度介质可用均一介质，在离心时自动形成（自生梯度如用铯盐或铷盐）亦可预先人工制备 如，蔗