大鼠胃促黄体生成素及其受体的免疫组化及原位杂交研究(一)(精)

1、大鼠胃促黄体生成素及其受体的免疫组化及原位杂 交研究（一）【摘要】 目的：探讨大鼠胃组织中是否表达促黄体生成素（LH 及其受体 （LHR）,为进一步研究 LH 对胃的功能调节提供理论依据.方法：采用免疫组织 化学 SABC 和原位杂交的方法进行研究.结果：在大鼠胃底腺的壁细胞和主细 胞呈 LH 和 LHR 免疫反应阳性.阳性物质分布于细胞质和细胞膜上，细胞核呈阴 性反应.上述细胞同样含有 LH 和LHR mRN 杂交信号，信号物质亦分布于细胞 质内，细胞核呈阴性反应.结论：大鼠胃壁细胞和胃主细胞既能产生 LH,又 能表达 LHR 说明 LH 对胃壁细胞和胃主细胞功能作用可能是通过旁分泌或自分

2、泌的作用来实现的【关键词】黄体生成素免疫组织化学原位杂交胃底腺0 引言LH（luteinizing hormone, LH） 及其受体（luteinizing hormone receptor,LHR）可以在下丘脑-垂体-性腺轴之外表达已经被公认.我们先前的实验已经证明，大鼠颌下腺的浆液性腺泡上皮细胞能够表达LH 及其受体1-2，但作为消化系统最重要器官之一的胃组织是否表达LH 及其受体，目前尚未阐明，本实验采用免疫组织化学和原位杂交等技术对该问题进行了研究1 材料和方法1.1 材料正常雄性 SD 大鼠，体质量（200 土 20） g,购自第四军医大学试验 动物中心；LH mAb 购自美国 Z

3、YME 公司；LHR 多克隆抗体、SABC 式剂盒与敏感 性加强型原位杂交检测试剂盒I型为武汉 BOSTE 公司产品；Vector 购自 TaKaRa 公司；地高辛标记随机引物标记试剂盒购自Roche; Hi ndIH，EcoRI 内切酶购自 New England Biolabs 公司；胶回收试剂盒购自 Promega 公司；DAB 显色试剂盒购自北京中山试剂公司.1.2 方法1.2.1LH 及其受体的免疫组织化学 SABC 法 SD 大鼠术前晚禁食不禁水，经 腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg ）麻醉，取出胃组织立即放入 Bouins 液中固 定，用石蜡包埋后将组织蜡块切成 4 mm 的

4、切片，并将切片贴附于 APES 处理过 的载玻片上，烘干备用将切片进行二甲苯脱蜡，先后各 10 min，无水乙醇 5 min，加入 30 g/L 甲醇中 20 min 以去除内源性过氧化物酶，然后按SABC 法进行 LH 及其受体的免疫组织化学染色，第一抗体： LH 抗体（1 : 500 稀释）和 LHR 抗体（1 : 300 稀释），在 4C冰箱孵育过夜，第二抗体：LH 和 LHR 分别为生物素标记的羊抗鼠或羊抗兔 IgG （1 : 200 稀释）， 室温孵育 2 h. SABC 复合物 （1 :200 稀释）室温孵育 30 min. DAB 显色 1015 min，蒸馏水终止反应，剃度乙醇

5、脱水，透明二甲苯两次，各 10 min，中性树胶封片.用正常兔血 清取代第一抗体进行孵育作阴性对照1.2.2LH 及其受体的标记探针根据文献2产生的克隆制备探针，分别从 LH 及其受体的上切下最初的 DNA 片段，长度分别为 150，650 bp，并进行回收，采用随即引物标记法进行标记，具体方法按Roche 公司的地高辛标记试剂盒进行：用灭菌去离子蒸馏水稀释1 卩 g DNA 至总体积 16卩 L;把 DNA 瓦置于沸水中，水浴 10 min.然后，迅速冰浴 3 min 以上，使 DNA 热变性；加 4 卩 L DIG Random Labeling Mix（ 高效），混匀后再 1000 g

6、离心 5 min，置 37C水浴反应过夜， 时间越长， 产量越高.延长反应时间至 20 h 可明 显增加地高辛标记 DNA勺产量，并加入 0.2 mmol/L EDTA 2 卩 L 以终止反应， 置-20C保存备用.1.2.3LH 及 LHR mRN 原位杂交程序用上述方法麻醉动物后，取出胃组织立 即放入用 Bouins 液（内含 1g/L DEPC）中固定，整个制片过程均防 RNA 酶污 染，切片厚度为 4 卩 m 将切片进行二甲苯脱蜡，先后各 15 min,剃度乙醇水 化，加入 30 g/L 甲醇中 20 min 以去除内源性过氧化物酶；胃蛋白酶活性 37C消化 30 s，以增加探针的穿透

7、力；4 g/L 多聚甲醛终止反应 5 min，以 终止蛋白酶 K 的作用；每张切片滴加含 2.0 mg/L 地高辛标记探针的原位杂交液 30 卩 l，置湿盒中 42C杂交 20 h ;分别用 37C预热的 2XSSC 0.1XSSC 洗涤 5 minX3，10 minX2;滴加小鼠抗地高辛抗体 37C，2 h，0.5 mol/L TBS 洗 涤 5 minX3;滴加生物素化羊抗小鼠 IgG 37C1 h，0.5 mol/L TBS 洗涤 5 minX3;滴加 ABC 37C30 min. 最后用 DAB显色液显色，室温 1015 min， 镜下观察其显色情况，水洗终止反应.梯度乙醇脱水，中性树

8、胶封片.阴性对 照分别用不含探针的杂交缓冲液取代含探针的杂交液，及用正常羊血清取代羊 抗地高辛抗体 IgG 进行孵育.2 结果2.1LH 及 LHR 免疫组织化学结果 LH 及 LHR 免疫反应阳性细胞呈棕黄色，背 底不着色，反差明显，阳性细胞很易鉴别，两种阴性对照实验均呈阴性反应.大鼠胃小凹上皮细胞呈 LH 与 LHR 免疫反应阴性，而在胃底腺壁细胞、主细胞均 呈阳性反应， 阳性物质分布于细胞质， 细胞核呈阴性分布， 但粘液细胞均呈阴 性反应 （图 1） .2.2LH 及 LHR mRN 原位杂交 LH 及 LHR mRN 杂交信号的细胞也呈棕黄色， 背底不着色，反差明显，阳性细胞很易辨认，

9、阴性对照试验呈阴性反应.在大鼠胃 LH 及 LHR mRN 杂交信号分布一致，阳性信号物质主要位于胃底腺壁细 胞、主细胞的细胞质内，细胞核呈阴性，但粘液细胞内的杂交信号均呈阴性反 应（图 2）.胃壁细胞（T）和主细胞（*）呈 LH 免疫反应阳性，阳性物质分布于细胞 质，细胞核呈阴性分布.图 1 大鼠胃底腺 LH 免疫组织化学染色 SABCX200 （略）阳性物质位于胃壁细胞(T)和主细胞(*)的细胞质内，胞核呈阴性.图 2 大鼠底腺 LH mRNA 杂交信号 DABX400 (略)3 讨论传统认为 LH 和绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin, CG)分别是由腺垂体嗜

10、碱性细胞、胎盘滋养细胞所分泌的糖蛋白，二者具有相似的立体结 构，并与表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF) 、神经生长因子 (nerve growth factor,NGF)等属于同一个超家族，因此 LH 和 CG 除了传统的内分泌作用外，它们也具有生长因子的特性近年来的许多研究表明，LH 及其 受体可存在于脑垂体之外，如前列腺3、卵巢4、睾丸5及颌下腺2等组织，这说明 LH 也可能异位合成并通过旁分泌或自分泌效应调节不同 类型细胞的功能这与本实验的研究结果是相一致的胃壁细胞是一种多功能的细胞，既能分泌多种生物活性物质，又有多种生 物活性物质的受体的表达6.我

11、们先前的研究已经发现，胃壁细胞既能表达 GnRr 又能表达GnRH 受体7，并且 GnRH 类似物对胃酸的分泌起一定的抑制 作用.我们近来的研究也发现8，胃壁细胞的促卵泡激素受体免疫反应呈阳性，并认为 FSH 对大鼠胃底腺壁细胞的功能可能有一定的调节作用本研究发现，大鼠胃壁细胞LH 及 LH 受体免疫反应呈阳性，提示该处可能存在的调节轴，对胃壁细胞功能进行调节，但是它究竟起哪种功能起调节作用有待进一步研究加以证 实胃主细胞是胃底腺中数量最多的细胞，其最主要的功能是分泌胃蛋白酶原近年来的研究表明，胃主细胞也是一种功能较多的细胞，如在主细胞上可表达 转化生长因子(transforming grow

12、th factor, TGF)和 EGF 受体，主细胞可以通过邻近壁细胞的旁分泌作用产生的 EGF 来调节壁细胞的9数量，还可以通过 EFG来调节胃脂肪酶的活性，其作用途径可能是通过有丝分裂蛋白激酶p42/44来实现的10本研究中发现，胃主细胞 LH 及 LH 受体均呈免疫反应阳性， 因此推测 LH 可能对主细胞的功能进行调节，其作用途径也可能是通过邻近壁细 胞的旁分泌作用，或是通过自分泌效应来调节细胞的生长及功能，但有待于进 一步实验加以证实【参考文献】1付建芳，黄威权,王世鄂，等大鼠下颌下腺卵泡刺激素、黄体生 成素的分布及与促性腺激素释放激素受体的共定位研究J解剖学报，2004, 35(6

13、): 652-655.2陈蕾，白宏伟，孙绪德，等.大鼠颌下腺 LH 及其受体的定位、核心 片断的克隆及序列分析J解剖学报，2007, 38(5): 572-576.3Sibley PE, Harper ME, Joyce BG, et al. The immuno cytochemical detection of protein horm ones in huma n prostatictissues J. Prostate, 1981;2(2):175-185.4Kobayashi M, Nakano R, Ooshima A. Immunohistochemical localizati

14、 on ofpituitary gon adotrophi ns and gon adal steroidsconfirms the two cel 1sXm gonador.rophnV hypo thesis ofsteroidogenesis in thehuman ovaryJ. J Endocrinol, 1990,126(3):483-488.5Zhang FP, Rannikko A, Huhtaniemi I. Isolation andchiT.cterizction oftesTs ypecific cDNAs for 1 ureini zing hormone bulc.

15、 Sl.bl.ri i I ii ihuITIL J.Biochem Biophys Res Commun, 1995, 210(3):858-865.6Schepp W, Dehne K, Herrmuth H, et al. Identification and functionalimportaneeII. I :ten飞on r;：:.t p;：:ri1 ccl I sJAm J Physiol, 1998, 275(5 Pt 1):G1094-1095.7Chen L, Sun XD, Zhao J, et al. Distribution, cloning and seque ncing of GnRH, its receptor, and effects of gastric acid secretion of GnRH analogue in gastricparietal cells of ratsJ.Life Sci, 2005, 76(12):1351-1365.8于辉，唐旭，吕葆真，等.卵泡刺激素受体在大鼠下颌下腺及