《基因工程原理》教案(完整资料)0001

1、【最新整理，下载后即可编借】基因工程原理教案（二O 二年修订稿）安徽大学生命科学学院第一章绪论重点：基因工程的概念和内容，基因工程技术在现代生物技术中 的地位和作用。难点：基因工程与遗传工程的区别。（一）前言生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等4个 部分。（二）什么是基因、基因工程应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一 具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过 转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再 进行扩增、提取获得大量同一 DNA分子拷贝或其表达产物。（三）基因工程的主要内容目的基因的制备载体的选择和制备 DNA分子的体外连接将

2、外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定（四）基因工程的历史及我国开展基因工程的现状第二章 基因工程的基本操作技术 重点：PCR技术和基因定点诱变技术。包括PCR技术的原理，反向PCR与染色体步移，不对称PCR与DNA序列测定，PCR 与RAPD, RT-PCR与RNA分析；基因定点诱变的原理，盒式 诱变，寡核昔酸引物诱变和PCR诱变。难点：酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序。（一）凝胶电泳技术在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以 DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、 RNA放到电场中，它就会由负极一正极移动。琼脂糖凝胶电泳聚丙烯

3、酰胺凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 RNA电泳（二）细菌转化技术转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质 中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传 基因和遗传性发生相应变化的现象。提供转化ONA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的 寄主菌株则称做受体菌株。常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法（三）核酸杂交技术所依据的原理是，带有互补的特定核昔酸序列的单链dna 或RNA,当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形 成双链的结构。 Southern blot ； Northern blotting;斑点印迹杂交和狭线印迹 杂交；菌落原位杂交注意比较核酸分子杂

4、交法的技术路线比较菌落原位杂交斑点杂交Southern 印迹Northern 印迹将核酸固定在膜上T预杂交（消除非特异吸附位点）-加入 核素标记探针进行杂交T漂洗膜（洗去非待异结合探针）T 放射自显影或显色反应示踪（四）DNA序列分析技术（四）DNA测序分析 DNA链末端合成终止法：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；该酶能够用21, 3 双脱氧核昔三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核昔酸链的3L末 端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA, 引物（特异性引物,如T7, T3, M13等）,DNA聚合酶,dA, dT, dG, dC和一种ddNTPo常用

5、Klcnow大片段，无53,外 切酶活性。 Maxam-Gilbert化学修饰法（哈佛大学）：该方法的基本原 理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成 碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产 物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA 片段的核昔酸序列。 DNA 杂交测序法（SBH-Scqucncing by hybridization）:如 果一段较短的ONA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成 完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补 序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。用一组已知系列 的寡核昔酸短序列做为探针，同某一较长的靶D

6、NA分子杂交, 从而测定其序列。（五）基因的化学合成（六）PCR技术 PCR反应体系的设立 PCR反应程序设计引物设计原理 PCR技术应用(七) 基因定点诱变技术使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、 插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白 质工程的重要手段。盒式诱变(cqsseu mutagenesis)包括盒式取代诱变和混合寡 核昔酸诱变两种方式。寡核昔酸引物诱变应用化学合成的含有突变碱基的寡核昔 酸短片投做引物，进行DNA复制，使寡核昔酸引物成为新合 成的DNA子链的一个部分 PCR诱变：重组PCR定点诱变、大引物诱变(八) DNA与蛋白质相互作用凝胶阻

7、滞实验(Gul wtardation assay),又称DNA迁移率变化 试验(DNA mobility shift assay, DMSA): DNA 与蛋白质结合后 分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发 生结合 DNasel印迹试验(DNasel foot printing)用于检测与蛋白结 合的DNA序列的部位及特性，形象地展示出一种特殊的蛋白 质因子同特定DNA片段之间的结合区域。甲基化干扰实验：根据DMS （硫酸二甲酯）能够使G残基甲 基化，而六氢毗唳又能够特异切割甲基化的G残基这一原理。 这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对于此 后的蛋白质结合作用究

8、竟会有什么效应，从而更加详细地揭示 DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局 限性时，它只能使G残基甲基化，但仍不愧为足迹实验的一种 有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作 用的精确位置。第三章基因工程的工具酶重点：限制性内切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶的生化特征、 作用原理和应用领域。包括II型限制性内切酶,T4DNA连接酶， 大肠杆菌DNA连接酶，大肠杆菌DNA聚合酶I, Klcnow酶， T4 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，反转录酶，Taq DNA聚合酶， Pfu DNA聚合酶和反转录酶。T4多核昔酸激酶、碱性磷酸酶和 末端转移酶的作用原理和应用领域

9、。难点：切口转移与核昔酸标记技术（一）限制性内切酶和甲基化酶在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生 链的断裂。两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不 是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。（二）DNA连接酶能够将DNA链上彼此相邻的3 -轻基（OH）和5 -磷酸 基团（-P）,在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二 酯键。只能连接切口（nick）,不能连接缺口（炉p）。而且被连接 的DNA链必需是双螺旋DNA分子的一部分。（三）DNA聚合酶1、Kco/iPo I 的特点（1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，

10、 该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5 -3外切 酶活性，大片段具3 -5外切酶活性和聚合酶活性（大片段 亦称为Klcnow片段）。（2）聚合酶活性5' 3，要求3' -OH引物和模板DNA,其延续性受反应 条件的影响2、Klcnow 片段由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产 生出来的大片段分子。仍具有5 一3的聚合酶活性和3 -5' 的外切酶活性，失去了全酶的5 一3外切酶活性。3、T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA 聚合酶，具有5 一>3'的聚合酶活性和3' 5外切酶活性。5 &g

11、t;3聚合酶活性,1500 nt/min,为Poll的两倍3' 5外切酶活性，可作用于ss DNA和ds DNA,其切除速度分别为40和4000nt/min4、反转录酶许多RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟 类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶（AMV） AMV具有oc链和卩链；住链具有聚合酶活性和RNase H活 性；卩链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5' ->3'脱 氧核酸外切酶活性5、T7DNA聚合酶 1978年，S. Tabor从感染了 T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞 中纯化出来的一种聚合酶。加工形式的T7DNA聚合酶系：T7噬菌体编码的基因5蛋

12、 白质，另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。基因5蛋白质：具有聚合酶活性和3 -5'外切酶活性； 硫氧还蛋白：增强基因5蛋白质与模板引物的结合力具有5 -3'的聚合酶活性和很高的单链及双链的3->5，核酸外切酶活性。(四)DNA和RNA修饰酶1、末端脱氧核昔酸转移酶与同聚物加尾末端脱氧核昔酸转移酶(terminal dcoxynucl cotidyl transferase)，从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性 蛋白质，在二甲肿酸缓冲液中，能催化脱氧核昔三磷酸进 行5' -3'方向的聚合作用，逐个地将脱氧核昔酸分子加 到线性DNA分子的3 -OH末端。

13、2、T4多核昔酸激酶由T4噬菌体的psuT基因编码的一种蛋白质，最初从T4噬菌 体感染的E. coli中分离出来。作用：催化丫-磷酸从ATP分子 转移给DNA或者RNA的末端，不受底物分子链的长短限制。3、来自于大肠杆菌(bacterial alkaline phosphatase BAP)或小牛肠 (calf intestinal alkaline phosphatase CIP),用于脱去DNA (RNA) 5末端的磷酸基团，使5 -P成为 5' -OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5'端同 位素标记或为了避免DNA片段自身连接(或环化)时可进行 脱磷酸反应。(五)

14、核酸外切酶ss DNAdsDNA大肠杆留外切酶I (exo I)大肠杆闘外切son(exom)大肠杆菌外切酶W (exoVD)噬苗体核酸外切酶(0)T7噬菌体基因6核酸外切俾第四章原核生物基因工程的载体重点:大肠杆菌质粒载体，包括pBR322和pUC18/19载体构建 原理和应用领域，蓝/白筛选，质粒DNA的制备和纯化；入噬菌 体载体，包括Xgtl()/ll和XEMBL3/4载体构建原理和应用领域，X 重组噬菌体的筛选；M13噬菌体载体，M13mpl8/19构建原理和 应用领域，单链DNA的制备；粘粒载体pJB8构建原理和应用领 域。难点：入重组DNA的转移和筛选()质粒质粒是细菌细胞内携带的

15、染色体外的ONA分子，是共价闭 合的环状 DNA 分子(covalent closed circular, DNA cccDNA),大 小在12()()kb,能独立进行复制。1、氯化艳密度梯度离心 质粒DNA占总DNA的1%2%;在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断 裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整 的状态；染色剂澳化乙锭(EB)能掺入到DNA链的碱基中，导致链 的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密 度会越低。2、碱变性法根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间， 在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH值12.012.5范围

16、内时,线性的DNA会被变性而共价 闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结 构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色 体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA3、质粒载体必须具备的基本条件具有复制起点自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。协助维持细胞内含有1()2()个左右的质粒拷贝具有抗菌素抗性理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。以便为寄主细胞 提供易于检测的表型性状做为选择信号，而且在有关的限制 酶位点上插入外源DNA后形成的质粒有一个选择标记。具有若干限制酶切单一位点（MCS）;具有较小的分子量和较

17、高的拷贝数。低分子量的质粒易于操 作，克隆外源片断后（不超过15kb）仍能有效的转化给受体 细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率 也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因（二）噬菌体载体1、入噬菌体的基因组结构（1） COS位点线性双链DNA分子两端各有一条12皿组成的彼此完全互 补的5'突出单链注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成为cos位点。2、插入式载体入噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一 般用于cDNA文库或基因组文库的构建。3、入替换型载体（取代型载体）外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段（20 kb）高感染效率（1

18、09转化株/ug载体DNA,比质粒高10（）倍）替换型噬菌体入是使用最广泛的载体。4、体外包装入重组体dna分子的转染作用由于入噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的75%或超 过1()5%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生 型DNA (48KB)的75%1()5%左右的DN A,要求入载体 DNA和外源DNA长度上限是51kb,必需基因为28kb,外源 极限在23kbo(三) 噬菌粒由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便 DNA的操作，可在细胞内稳定存在；具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体帮助下，可进 行噬菌体

19、的繁殖，产生单链的子代噬菌体。(四) 柯斯质粒载体(Cosmid vector ) cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记入噬菌体用于包装的cos末端载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体 外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。 但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于 细胞内。（五）单链DNA噬菌体载体M13、Fl、fd Ml3是一种含单链（+ ） DNA （ssDNA）的丝状大肠杆菌 噬菌体，其基因组大小为6.4kbo这类载体主要用来获得大 量的单链DNA片投，这种单链DNA片段在遗传学研究 中主要用来测定DNA序列（sangtr双

20、脱氧法）、基因的定 点突变研究、异源双链DNA的分析等。 M13噬菌体载体的寄主菌：由于M13噬菌体通过F因子编 码的菌毛进入宿主细胞，故只能用雄性细菌来增殖病毒。注意比较载体的特点：质粒脛m体柯斯廣粒单体克隆DNA大片段+构建基因组文库+构建DNA文庠+當规的亚克隆化+构建新型的DNA结构+序列分析+单琏探针+外源基因在大肠杆菌中的表达+（六）人工染色体随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的日益深入，对可插入 大片段DNA的克隆载体人工染色体的研究取得了迅速的发 展所谓人工染色体是一类能在生物细胞中独立“稳定存在和 遗传的人工重组DNA分子”酵母人工染色体载体（yeast artificia

21、l chromosome, YAC, lOOOkb）酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS）酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）酵母染色体的端粒顺序（TEL）:细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC , 3OOkb ）哺乳类人工染色体（MAC） Pl衍生人工染色体第五章基因的分离、重组和鉴定基因的克隆，实质上包含着待研究的目的基因的分离与鉴定 两个主要内容，克隆步骤包括四个步骤用于基因克隆的DNA材料的选择，及DNA分子的片段化外源DNA片段与载体分子的体外连接反应将人工重组的DNA分子导入他们能够进行正常复制的寄 主细胞的程序对重组体分子的转化子克

22、隆进行筛选一、基因组DNA的片段化1、利用限制酶片段化基因组DNA(1) 鸟枪法(shotgun approch)(2) 随机片段法构建基因文库时，最好采用随机片段化的办法制备克隆片段机械 切割法、限制酶局部消化法二、外源DNA片段同载体分子的重组主要依赖于核酸内切酶与连接酶的作用，选择外源DNA同 载体三、重组子分子导入受体细胞的途径原核生物的转化与转染：常用大肠杆菌K12突变体菌株(丧 失限制体系)四重组子分子的选择与鉴定1、遗传检测法2、物理检测法3、菌落或噬菌斑杂交筛选法4、免疫化学检测法5、蛋白质筛选法6、转译筛选法第六章基因克隆的策略从生物有机体中克隆某一特定DNA片段(或基因)的

23、实验程序1、cDNA基因克隆（cDNA文库）2、基因组DNA克隆（DNA文库）3、基因定位克隆（一）cDNA libraries 的构建mRNA isolation,卫 unificationCheck thf RNA integrityFractionate and enrich mRNASynthesis of cDNA g MM. Treatment of cDNA endsLigation to vectoF（二）基因组DNA克隆基因文库（gene libranO :用重组DNA技术将某种生物细胞 的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上, 然后转移到适当的宿主细胞中通过细

24、胞增殖而构成各个片 段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部 基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种 生物的基因文库。【最新整理，下载后即可编cukarv'otcs prog 基因组I）NA的片段化（物理切割和限制性内切酵）(三) 克隆基因的分离1、应用核酸探针可以将基因文库或者cDNA文库转移至硝酸纤维素膜后， 用特异性的探针同噬菌斑或者菌落进行杂交，可以筛选出 阳性克隆2、应用差别杂交或扣除杂交法差别杂交(differential hybridization ),又称差别筛选 (differential screening )适用于分离经特殊处理而被诱发表达

25、的 mRNA 的 eDNAo扣除杂交(subtractive hybridization),又叫扣除 cDNA 克隆 (subtractive cDNA cloning)，通过构建扣除文库得以实现。抑制性扣除杂交：以抑制PCR为基础的DNA扣除杂交方 法3、应用mRNA差别显示技术(DDRT-PCR) 一般用20种随机引物和12种3 -端锚定引物组成的全部 240组引物对PCR扩增后，所产生的大约20 ()()()条条带， 基本涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全 部的mRNAo4、cDNA差式分析法(RDA)5、表达序列标签法(ESTs) ESTs (Expressed Sequence tags )是从已建好的 eDNA 库中 随机取出一个克隆，从5末端或3'末端对插入的eDNA 片段进行一轮单向自动测序，所获得的约6()-5()()bp的一段 eDNA序列。6、基因表达系列分析法(SAGE)分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签(约 9-14个碱基对，Sequence Ta