质粒的限制性内切酶反应

1、分子生物学实验分子生物学实验实验质粒的限制性内切酶反应分析分子生物学实验分子生物学实验v1 1、掌握限制性内切酶的工作原理，掌握酶、掌握限制性内切酶的工作原理，掌握酶切体系建立原则切体系建立原则v2 2、熟悉基因工程所用的限制酶的特点、熟悉基因工程所用的限制酶的特点分子生物学实验分子生物学实验实验原理实验原理能特异地结合于一段被称能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链附近的特异位点上，并切割双链DNA。u 。分子生物学实验分子生物学实验限制性内切限制性内切酶酶酶分子酶分子识别位点识别位点切割位点切割位点 限制作用

2、是限制作用是否需用否需用 ATP类类 三亚基双功三亚基双功能酶能酶 二分非对称二分非对称至少在识别至少在识别位点外位点外 1000 bpYes类类(93%)内切酶与甲内切酶与甲基化酶分子基化酶分子不在一起不在一起4-6 bp, 大多大多数为回文对数为回文对称结构称结构 在识别位点在识别位点中或靠近识中或靠近识别位点无特别位点无特异性异性No类类二亚基双功二亚基双功能酶能酶 5-7 bp 非对非对称称在识别位点在识别位点下 游下 游 2 4 -26bpYes分子生物学实验分子生物学实验v类类限制性内切酶限制性内切酶v分子克隆中常用的为分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点类限制酶，其识别位点

3、长度为长度为4、5或或6个核苷酸的反向重复序列。限个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘性末端的片段，而另一些产生带有粘性末端的DNA。如。如EcoR切割识别序列后产生两个互切割识别序列后产生两个互补的粘性末端补的粘性末端： 5GAATTC3 5 G AATTC3 v 3CTTAA G 5 3 CTTAA G5分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验实验仪器与试剂实验仪器与试剂v仪器：仪器：恒温水浴锅、离心管、移液器、枪头、离恒温水浴锅、离心管、移液器、枪头

4、、离心机、电泳设备等。心机、电泳设备等。v试剂：试剂： pUC19质粒，质粒，EcoR I酶，酶切缓冲液，琼酶，酶切缓冲液，琼脂糖，电泳缓冲液，脂糖，电泳缓冲液，EB，10 x上样缓冲液，上样缓冲液，无菌水等。无菌水等。分子生物学实验分子生物学实验v1、在一个洁净的、在一个洁净的0.5 ml离心管中混匀下列反应物离心管中混匀下列反应物反应物反应物体积（体积（l）dd H2O510Buffer1.5质粒质粒DNA (1g)8EcoR I (10U)0.5最终至最终至15 l6000 rpm/min稍离稍离15 s，将反应物置于，将反应物置于37水浴中温浴水浴中温浴12 hr。分子生物学实验分子生

5、物学实验v2、6000 rpm/min稍离稍离15 s，将反应物置于，将反应物置于37水浴中温水浴中温浴浴12 hr。v3、配胶：称取、配胶：称取1.4 g琼脂糖粉末，加入琼脂糖粉末，加入160 ml 1xTAE （配（配2瓶）瓶） ，反复煮沸三次后，待冷却至约，反复煮沸三次后，待冷却至约60 后，倒后，倒胶，等待凝固（约胶，等待凝固（约30 min），得到），得到1%凝胶。凝胶。v4、酶切完成后，稍离，加入、酶切完成后，稍离，加入2 l 10 x上样缓冲液混匀，上样缓冲液混匀，然后上样。另上样然后上样。另上样20 l Marker，以及，以及1份份10 l 质粒质粒（混合（混合2 l 10 x上样缓冲液）作为对照，上样缓冲液）作为对照，120V电泳电泳1hr。v5、在紫外分析仪（凝胶成像系统）上观察酶切的结果。、在紫外分析仪（凝胶成像系统）上观察酶切的结果。分子生物学实验分子生物学实验电泳检测示例分子生物学实验分子生物学实验注意事项 分子生物学实验分子生物学实验g DNA(较高的甘油浓度较高的甘油浓度 )分子生物学实验分子生