傣药资源品种整理与分子鉴定

1、傣药资源品种整理与分子鉴定傣药是我国四大民族药之一 , 是我国民族医药的重要组成部分。 由于受自然、 历史条件以及历代傣医药本草文献记载不详等影响 , 傣药材的同名异物、同物异 名现象普遍存在 , 造成了傣药的品种不清和使用混乱。为了澄清傣药资源的品种情况 , 建立傣药材鉴定体系 , 为推进傣药材的产业 化进程提供科学参考。 本文采用文献分析法、 民族植物学和数理统计分析方法对 傣药材开展了系统整理研究。在此基础上,采用数据库构建和DNA条形码技术,建立了傣药材DNA条形码数 据库；并探索了 DNA条形码技术和高分辨熔解曲线技术,以及二者结合在傣药材 鉴定和市场监管中的应用。主要研究结果和结论

2、如下 :1. 本研究收集整理了前人 近 40年的研究成果 , 引用专著 35 本, 期刊文献 143篇, 采用专业数据库查询验证 , 共收集到傣医学药物信息 8590 条。去除无拉丁名或拉丁名无法确认的药材信息 97 条, 获得傣药材有效信息 8493条。将上述物种拉丁名进行同异名处理后 , 以接受名 (Accept name) 作为唯 一字段, 对目前傣医学记载使用的 1654种药物从从植 / 动/ 矿物名、傣文名、科、 药材名、部位、拉丁名、功能主治、文献来源、标准收载等进行修订 , 编制了傣 族药物资源编目信息集。2. 在上述研究基础上 , 采用民族植物学研究方法和数理统计方法对傣药材资

3、 源种类、传统利用特点、质量标准等方面进行了系统的整理和分析。 结果表明 :2.1 傣医学使用的药物种类丰富 , 目前已记载的使用的药物共有 1654 种, 其中植物药 1491种, 分属于 191科, 836 属, 包括地衣类 2 科 2 属 4 种, 真菌类 7 科 9 属 9 种, 苔藓类 1科 1 属 1 种, 藻类 2科 2属 2种, 蕨类植物 19 科 26属 42种, 裸子植物 7 科7属13种,被子植物 153科789属1420种;动物药 141种,分属于 90科123 属; 矿物药 22种。在傣医使用 1491种傣药植物中 ,为我国特有分布的药用植物有 159种, 分属 于7

4、0科133属;被列入濒危珍稀名录保护的有 152种,分属 62科133属;动物药 中,列入保护的珍稀濒危动物种数有 68 种, 占动物类傣药总数的 48.22%。2.2 从 使用特点来看 , 傣族植物药的药用部位以根及根茎类入药频次最高 ,其次为全草 类和叶类。主治疾病方面 ,植物药中主治疾病最多的是消化系统疾病 , 其次分别是针对 各种体征、损伤、循环系统、皮肤、呼吸以及泌尿系统等疾病 ; 动物药则以皮肤、 体征和循环系统疾病为最多 , 其次是消化系统和传染病 ; 矿物药主要为皮肤和循 环系统疾病。从使用方法来看 , 植物药以汤剂用法最多 ,其次是各种贴剂 （外敷或 外搽）; 动物药多以粉剂

5、形式使用 ,其次是贴剂;矿物药则多为外用 ,以贴剂（涂抹 敷患处）方式为主。2.3 傣药材质量标准整理结果表明 , 目前共有 785个傣药材被各级标准收载 , 占傣药材总数的 47.46%,其中被中华人民共和国药典收载的药材品种有 327 个。以豆科和大戟科为例 , 从药材名称、品种和基原、部位、功效、质量标准等 方面的分析表明 ,目前傣药材的“品种-名称-基原”不规范的情况普遍存在 , 在其 药用部位和功效表述上仍有待规范 ; 傣药材的质量标准极不完善 , 阻碍了傣药的 产业化进程。应进一步加强傣药的本草考证、资源与使用现状调查 , 并结合现代药物研究 技术开展系统研究 ,推动傣药材的品种整

6、理和质量标准体系建立工作。 3. 采用试 剂盒法提取傣药材的基原植物总 DNA通过PCRT增其ITS2序列或psb A-trn H 序列并双向测序。应用 Codon Code Aligner 5.1.5 对测序峰图进行校对拼接 , 去除低质量序列 及引物区 ,获得傣药材 ITS2 序列或 psb A-trn H 序列,建立了 300种常见傣药材 的DNA标准序列；在此基础上,基于课题组前期研究和数据库技术,结合分析Gen Bank序列,采用BLAST分析防错、系统树分析防错等方法核验序列的可靠性,建立了傣药材DNA条形码鉴定系统,该库由样品数据库、序列数据库组成,包含1000 余种傣药材和大量

7、混伪品及密切相关物种。4.采用DNA条形码技术对“哈宾蒿”、 “芽杆庄”、“芽灵捂”、“贺帕举雷” 4种傣药材及其混伪品的鉴别进行了研究 , 同时探讨了高分辨熔解曲线技术在傣药材鉴别中的应用。结果表明DNA条形码和高分辨熔解曲线技术可有效用于傣药材及其混伪品 的鉴别 , 其操作易于流程化 , 标准化, 为傣药的临床用药安全和市场监管提供了强 有力的工具。 4.1 基于大青属 (Clerodendrum)12 种植物共 48份样品和 Gen Bank 下载序列 , 构建大青属 ITS2 和 psb A-trn H 条形码数据库。应用该数据库对 27份购自市场的“哈宾蒿”药材及饮片进行鉴定 , 结

8、果表 明,ITS2序列种间最小变异大于种内最大变异,而psb A-trn H 序列种间最小变 异则小于种内最大变异。因此,ITS2序列作为条形码能稳定、准确鉴别“哈宾蒿” 药材及其混伪品。市场药材调查研究表明 , 市售哈宾蒿基原物种来源复杂 ,27 份药材中仅有一 份为C.japonicum(ThunbJSweet,应用DNA条形码技术能对流通市场进行有效监 管。 4.2 基于重楼属 (Paris) 及其易混品 9种植物共 30份实验样本 , 构建“芽杆 庄”及其易混品的高分辨熔解曲线鉴别模型。应用该模型对 10 份购自市场的“芽杆庄” 药材进行鉴定 , 全部药材能够归属 到相应的物种类群，进

9、一步的DNA测序比对结果与高分辨熔解曲线分型一致，表明高分辨熔解曲线用于药材市场流通监管是可行的。 4.3基于耳草属 Hedyotis 16 个物种共70条ITS2序列构建“芽灵捂” (H.diffusa Willd.)及近缘物种DNA条形码数据库 , 结果表明基于 ITS2 序列构建的系统发育树 , 以及比对法和最小距 离法均能够明显区分耳草属 16 个物种。应用该数据库对市场收集的 15份“芽灵捂”药材进行鉴定 ,比对结果显示 7 份药材与白花蛇舌草相似度最高 , 聚为一支 ,3 份药材与纤花耳草具有高度相似 性,聚为一支,余者为其他物种。而后根据 DNA条形码研究结果,选择已知基原的 “

10、芽灵捂” (H.diffusa Willd.) 及其混伪品,利用高分辨熔解曲线技术对其进行 鉴别, 结果显示高分辨熔解曲线能有效鉴别“芽灵捂” (H.diffusa Willd.) 及其 混伪品。4.4基于ITS2序列，对42份收集于市场的贺帕举雷(Saposhnikovia divaricata(Trucz.)Schischk.) 药材进行研究 , 结果表明 ,12 份药材与防风相似 度最高 ,15 份与竹叶防风相似度最高 ,5 份与杏叶防风相似度最高 ,8 份与华山前 胡相似度最高 ,1 份与葛缕子相似度最高 ,1 份与白花前胡相似度最高。 基于 ITS2 序列构建的系统发育NJ树以及比对法(BLASTl)和最小距离法(Nearest distanee) 均能够明显区分上述六个物种。利用高分辨熔解曲线技术对 4种已知基原的“贺帕举雷” 及其混伪品药材进 行鉴别, 结果显示高分辨熔解曲线能有效鉴别“贺帕举雷”及其混伪品。本研究 表明市售贺帕举雷 (S.divarieata(Truez.)Sehisehk.) 药材基原物种来源复杂 , 应用DNA条形码分子鉴定法和高分辨熔解曲线法能够对药材流通市场进行有效 监管综上所述, 本研究系统地对傣药材资源品种进行了整