沈萍 微生物学 第十章微生物与基因工程

1、微生物与基因工程 genetic engineeringGenetic engineering 基因工程：实现基因克隆所采取方法及相关的工作统称为重组DNA技术或重组DNA工艺学或基因工程一 重组DNA技术相关概念Clone :来自同一始祖细胞的相同副本或拷贝的集合；获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)也就是无性繁殖。DNA clone:应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子（复制子replicon），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆，又称为重组DNA re

2、combinant DNA。replicon 复制子：在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子。DNA chimeras嵌合DNA：克隆某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子，称为嵌合DNA。二 基因工程基本过程1基因的分离或合成：基因文库或cDNA文库分离；化学合成；PCR；定点诱变改造基因2外源基因与载体DNA的体外重组：利用重组DNA技术将外源基因插入质粒、病毒或染色体DNA构建成的载体中含有自主复制起点的“重组DNA分子”3重组DNA导入宿主细胞通过转化、转染或感染等方式将重组DNA导入微生物或动植物细胞中，使其复制

3、，获得克隆4目的基因的筛选与鉴定：获得克隆后进行鉴定和测序5控制外源基因的表达：控制适当条件是导入基因在细胞内表达，产生产品，或使生物体获得性状。获得新性状的微生物称为工程菌，新类型的动植物非别称为工程动物和工程植物或转基因动、植物三 微生物与基因工程的关系：1微生物为基因工程提供了及其丰富的基因资源；2基因工程所用的载体主要由质粒、噬菌体和其他病毒DNA改造而成；3基因工程所用的工具酶绝大多数从微生物中分离纯化得到；4微生物细胞是基因克隆的宿主，即使动、植物基因工程也需要构建穿越载体；5微生物是基因表达的生物反应器；6微生物研究能为基因工程提供理论研究第二节 基因的分离、合成的定位诱变一 从

4、基因文库或cDNA文库中分离目的基因target gene1从基因文库中分离目的基因：先构建基因组文库后筛选目的基因target gene有两种类型：cDNA和基因组DNA。gene library 基因文库：是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。cDNA complementary DNA：指经反转录合成的、与RNA（通常为mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。genetic DNA 基因组DNA：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有DNA序列。（1）gene library 构建分为五步：1从组织或细胞中提取基因组DNA；2利用限制性酶水解或机

5、械剪切力将其切成适当长度的DNA片段；3选择克隆载体，通常采用噬菌体载体或粘粒载体；4基因组DNA片段与载体DNA进行体外连接；5重组DNA直接转化细菌或用体外包装的重组噬菌体粒子感染敏感细菌细胞，最后得到基因文库。（2）基因文库中筛选目的基因利用标记基因探针、限制性内切酶、PCR或其他方法从文库中筛选出目的基因。常将克隆菌落或噬菌斑转印到滤膜上再用基因探针与之杂交；若构建基因表达文库，可通过检测基因产物来筛选。2 从cDNA文库中分离基因cDNA library cDNA文库：指细胞全部mRNA为模板逆转录成cDNA，与适当载体接合转入受体菌，即获得cDNA文库。mRNA 丰度 mRNA a

6、bundance：指一种特定的mRNA在某个细胞中的平均分子数。低丰度的mRNA需要由公式计算出使其存在概率达99%的最低克隆数目（1）cDNA文库构建A 具体方法为五步： 1从组织或细胞中提取基因组mRNA；2利用逆转录酶以寡聚（dT）or随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA第一条链；3利用DNA pol I以cDNA第一条链为模板，以适当引物合成第二条链。常用RNA 酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口或缺口，水解留下的RNA片段即可作为引物，或除去杂交分子的mRNA后加入随机引物即可合成第二条链；4cDNA与载体体外连接；5噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不含基因启动子和内含

7、子，故序列比基因短，克隆载体可用质粒或病毒载体。B cDNA文库的优点：1筛选到目的基因，通常细胞中仅有15%左右基因被表达，故cell中mRNA分子种类数比基因组的基因数小很多，故易表达；2 cDNA 文库对克隆和表达真核生物基因更重要，因真核生物基因含内含子，在原核细胞不表达，而筛选到的cDNA 克隆只要附上原核的调节和控制序列就能在原核细胞表达。（2）从cDNA文库中筛选目的基因 方法同从基因文库中筛选二 基因化学合成DNA化学合成法科拉纳Khorana 1986年获诺贝尔医学奖用于 合成基因或基因元件，如1977 板仓敬一 合成14肽生长激素抑制剂因子的基因；合成核酸探针；合成DNA引

8、物，用于DNA测序，PCR扩增和定位诱变。三 PCR扩增基因聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR 是一种快速扩增特定DNA序列的技术，1984 Mullis 1 PCR扩增原理：PCR基本反应步骤：1变性，反应体系加热至95，使模板DNA完全变性称为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也消除；2 退火，将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5）使引物与模板DNA结合；3 延伸，将温度升至72，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。经多次循环（25-30）即可达到扩增DNA片段目的（106-107倍）。2 来自微生物的耐高温DNA聚合酶， P

9、CR最初使用Klenow酶，此酶高温易变性后被以下三类替代：（1）Taq DNA pol ：高温、但缺乏校正功能，萨奇1988 水生栖热细菌分离到（2）Pfu DNA pol和Vent DNA pol：耐高温、有校正功能，分别来自火球菌和极端耐热细菌。（3）Tth DNA pol： 同时具有逆转录酶活性，可使RT-PCR在同一系统中进行。即使存在极少量RNA（小于100个拷贝）也能逆转录和扩增，可用于研究细胞RNA和RNA病毒。是从嗜热细菌中分离3 PCR应用扩增基因和制备DNA探针；定位诱变和DNA测序；传染病检测、遗传病诊断和对癌基因的分析确定；PCR与指纹图谱结合使用可指证嫌犯和个体血缘

10、关系确定。四 基因定位诱变site-directed mutagenesis 基因定位诱变：按照设计要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重组等变异。目前常用定位诱变方法：酶切位点处插入、删除和置换序列、用寡核苷酸知道的诱变和PCR诱变。1寡核苷酸指导的诱变:oligonucleotide-directed mutagenesis的主要步骤：制备单链DNA模板（如M13单链模板）；合成诱变寡核苷酸，其中引入诱变位点；寡核苷酸与模板退火合成异源双链DNA；闭环异源双链DNA分子富集；转染宿主细胞，M13在大肠杆菌中扩增形成噬菌斑；突变体筛选与鉴定（DNA测序鉴定or 利用含变异碱基的寡核苷

11、酸探针杂交筛选）2盒式诱变cassette mutagenesis：是一种定点突变技术，将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代，称为盒式诱变。通常做法是：将目的基因变异部位附近找两个限制位点，利用合成的限制性核酸内切酶将二者之间的DNA序列切掉，有一段人工合成的含变异序列的双链DNA取代，从而实现基因定位诱变。3 PCR定位诱变已知基因两端和需要变异部位的序列就可用PCR诱变法改造基因序列。故PCR诱变已经成为最常用定位诱变方法。nested PCR 嵌套式PCR：PCR的引物通常在扩增DNA片段的两端，但有时需要诱变的部位在片段中间，这时可在DNA

12、片段中间设置引物，引入变异，然后在变异位点外侧再用引物延伸，此称为嵌套式PCR（1）若变异部位在基因末端，只需引物含有变异碱基即可。（2）变异部位在基因中间，借助重组PCR的方法recombinant PCR进行定位诱变，可在DNA片段任意部位产生定位诱变。需要诱变的位置合成一对含有变异碱基的互补引物，然后分别于5引物和3引物进行PCR这样可得到两个PCR产物分别含有变异碱基，由于二者间有一段部分互补重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到变异的PCR产物，还使不同基因片段之间发生重组连接。（对照P273页图）定位诱变技术可用于基因和蛋白结构与功能的研究，进行分子设计改造天然蛋白，通过改变蛋白分子

13、中特异AA序列从而获得有益蛋白突变体。第三节 微生物与克隆载体cloning vector 克隆载体：将外源DNA代入宿主细胞并进行复制的运载工具，可自主复制，是复制子。对载体的要求是：由自主复制能力，是独立的复制子replicon，含有复制起点；含有多克隆位点，即含有若干限制酶单一切点，便于外源基因插入；携带易于筛选的选择标记；具有一定安全性，在胞内不发生重组与转移，在胞外不能够自由扩散；尽量小，以便于导入细胞进行繁殖，使用安全。目前广泛使用的克隆载体基本上均来自微生物，主要由5类：质粒载体、噬菌体载体与黏粒载体、M13噬菌体载体与噬菌质粒载体。一 质粒载体1977 Bolivar等由天然质

14、粒删除、融合、转座及重排之后构建的克隆载体pBR322，全长4361bp，含tetr和ampr两个抗性基因，为松弛型控制relaxed control。relaxed control松弛型控制：质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒，这样的控制形式称之为松弛控制型。stringent contral严谨型控制：严紧型质粒的复制受到严格的控制，每个细胞中的数量只有12个，它们似乎与染色体的复制受相同因素的控制，在一定的细胞周期内复制；染色体不复制时，质粒也不复制。含有一个人工构建的多克隆位点multiple cloning site 可随意

15、插入任一位点。pUC系列质粒包括四个组分：pBR322的复制起点；序列经改造的ampr标记基因；乳糖操纵子调节基因lacZ、启动子和-半乳糖苷酶-肽；位于lacZ靠近5端的多接头或称多克隆位点MCSIPTG可诱导pUC质粒载体发生-互补，使X-gal被分解产生蓝色。二 噬菌体载体与黏粒载体1 噬菌体载体噬菌体大小50Kb左右，约有三分之一对其复制和装配不是必须，故可被替换。DNA两端有黏性末端，由12个核苷酸组成，进入宿主细胞后DNA两端黏性末端自动结合成环状。DNA可通过两条途径增殖：裂解途径（lytic pathway）和溶原途径（lysogentic pathway）lytic path

16、way 裂解途径：环状DNA经多次复制后，才合成病毒蛋白，装配出许多子代病毒粒子，最终导致宿主细胞裂解，释放出许多病毒颗粒。lysogentic pathway 溶原途径：噬菌体DNA插入到细菌染色体DNA中，随染色体DNA复制而复制，细胞内没有噬菌体颗粒，某些因子可诱导细菌经裂解途径产生噬菌体。噬菌体载体可分为插入型（insertion）和置换型（substitution），前者用同一限制酶切开后将外源基因配伍末端与载体两臂相连即可；后者需切除载体一个片段再将外源基因与之置换。噬菌体载体最多携带23Kb外源DNA，可100%转化，而质粒DNA转化率只有0.1%。DNA经滚环复制使单位长度基因

17、组串联成一条长链，称为多连体concatemer，彼此以cos位点连接。噬菌体编码的A蛋白在cos位将DNA交错切开，进行装配，只要DNA中有cos位点就可以与外壳蛋白进行装配。2 黏粒载体层称为柯斯质粒载体含有cos位点可感染大肠杆菌并装配成噬菌体颗粒的质粒称为柯斯质粒（cosmid），可携带35-48Kb外源DNA，用于构建基因组文库（genomic library）。黏粒特点：克隆外源DNA能力远超过质粒载体和噬菌体载体，可携带35-48Kb外源DNA；在宿主细胞以质粒形式复制，外源基因插入到两个cos位点之间形成重组DNA，并通过体外包装称为噬菌体克隆然后感染大肠杆菌，将其DNA注入细

18、胞中，两个cos位点连接成环状DNA分子噬菌体载体可用于构建基因文库和cDNA文库；黏粒载体由于可携带更大DNA片段故可用于构建基因文库。三 M13噬菌体载体与噬菌粒载体1 M13噬菌体载体 M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状单链DNA（ssDNA），6407bp，感染雄性大肠杆菌（F+ or Hfr）后变成复制性（RF）dsDNA，后以滚环复制方式复制出ssDNA。被装配和将子代噬菌体释放至胞外。M13噬菌体除基因间隔区（IG）外，其他均为复制和装配所必需基因。M13噬菌体特点：A 在M13复制型的基因间隔区外中插入-半乳糖苷酶N端小段编码序列及其调控序列，该序列编码-半乳糖苷酶的-

19、肽，-肽可与大肠杆菌lacZ突变基因（lacZ）的M15产物进行互补，产生具有活性的-半乳糖苷酶。M13和大肠杆菌涂布在含IPTG和X-gal平板上，可形成蓝色噬菌斑；B 在-肽编码区内插入若干限制酶单一切点，当外源基因插入这一区段会破坏互补作用，使-半乳糖苷酶失活，此携带外源基因的重组噬菌体产生白色噬菌斑，便于筛选。M13载体只能克隆300-400bp外源DNA，长用于制备测序的单链DNA、单链DNA探针、定位诱变模板、噬菌体展示。2 噬菌粒载体phagemid噬菌质粒：又称噬粒，当质粒含有噬菌体的复制起点时，称为噬菌质粒，可在有关噬菌体的帮助下按噬菌体方式复制和装配。由噬菌体M13基因间隔

20、区（含有M13的复制起点）和质粒DNA（韩质粒复制起点、抗生素抗性基因标记和多克隆位点区）共同构建而成的载体。（微生物定义）噬菌粒在宿主细胞以质粒的复制起点进行复制，产生dsDNA，当其与M13辅助噬菌体同时感染宿主细胞，噬菌粒就以M13的复制起点进行复制，产生ssDNA并装配成噬菌体粒子释放至胞外。噬菌粒优点：载体本身分子小，约3Kb，便于分离操作；可克隆10Kb外源DNA片段，克隆能力胶M13噬菌体载体大；可用于制备ssDNA或dsDNA，克隆和表达外源基因expression vector 表达载体：插入控制外源基因在宿主细胞内表达的序列，称为表达载体。phage display tec

21、hnology 噬菌体展示技术：是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。该技术主要用噬菌体M13作为载体。宿主细胞要满足的要求：易于接受外源DNA，为感受态细胞（competent cell）；宿主细胞必须无限制酶，即其防护宿主DNA系统（host safeguarding DNA system ，hsd）应为S-、R-、M-（意味限制-修饰系统酶的三个蛋白亚基缺失去）；宿主细胞无重组能力；宿主细胞易于生长和筛选，克隆的选择标志必须与之匹配（如载体带有-肽基因lacZ，

22、其宿主细胞的-半乳糖苷酶基因必须是突变体lacZM15）；符合安全标准，工程菌在自然界不能独立生存。四 真核生物的克隆载体1 酵母质粒载体：大都具有酵母复制起点和大肠杆菌质粒pBR322复制起点，故可在酵母和细菌中复制，都属于穿梭质粒载体，主要分为3类shuttle plasmid 穿梭质粒：若质粒含有两种宿主细胞中复制起点，可在两种细胞中复制和存在，则称为穿梭质粒。真核生物克隆载体为便于操作，常现在大肠杆菌中扩增，将目的基因与只构成合适重组体后才转入真核细胞。（1）附加体质粒附加体质粒yeast episomal plasmid，YEP：含有酵母可选择遗传标记URA3基因（尿嘧啶核苷酸基因合

23、成酶3）和酵母2质粒的复制起点，同时还含有大肠杆菌的复制起点和选择标记（Ampr和Tetr）在酵母细胞内以高拷贝数存在。（2）复制质粒复制质粒yeast replicating plasmid，YRP：含有酵母染色体DNA的自主复制序列ARS，同时还含有大肠杆菌的复制起点和选择标记（Ampr和Tetr），以中等拷贝数存在于酵母细胞内。（3）整合质粒整合质粒yeast integrating plasmid，YIP ：含有酵母可选择遗传标记URA3基因（尿嘧啶核苷酸基因合成酶3），但无酵母复制起点，在酵母细胞内只有整合到染色体中才能稳定存在，因含有大肠杆菌的复制起点和选择标记（Ampr和Tetr

24、），可在大肠中复制。2 Ti质粒载体Ti质粒载体约200Kb，内含一段T-DNA能够将所携带DNA转化到植物细胞并整合到染色体DNA中使许多双子叶植物产生冠瘿病，故Ti质粒是目前植物基因工程最常用基因载体。T-DNA的转移与整合主要借助：T-DNA两侧25bp的正向重复序列（分别称为左端边缘LB和右端边缘RB），且只有这两个序列之间的DNA才被转移；Ti杂志里中的vir毒性区段某些基因产物，已知Vir蛋白时核酸内切酶可在T-DNA两端进行切割形成两个单链切口，使T-DNA单链从Ti质粒中释放出来，然后5端RB序列与另一种Vir蛋白结合并在其引导下把T-DNA转移和整合到植物染色体上。Ti 质粒

25、太大，于是有了Ti质粒的衍生物作为植物克隆载体。如二元载体系统binary vector system 由一个克隆载体和一个辅助质粒共同组成。A 克隆质粒：通常为大肠的一种小质粒，其含有T-DNA两个末端序列，对于T-DNA的整合使必需的；还含有大肠杆菌和根癌土壤农杆菌的复制起点，使其可在两种细菌中穿梭；常含两个选择标记基因，一个可在大肠中表达（如kanr），一个可在植物中表达（对植物有剧毒的新霉素抗性基因neor）；含有多克隆位点，便于外源DNA插入。B 辅助质粒helper plasmid是一个删除T-DNA区并经修饰的Ti质粒，含有一整套vir基因。当外源基因插入克隆载体导入大肠，经接合

26、转移进入根癌土壤农杆菌内（该菌含辅助质粒）最后外源基因由T-DNA携带并在vir基因作用下转移并整合到植物细胞染色体DNA中。由转化细胞发育称为获得新遗传性的完整植株。3 真核生物病毒载体（1）哺乳动物病毒载体：SV40、腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等经改造后的衍生物作为基因载体。优点是：能有效识别宿主病毒；有些能高效整合到宿主基因组中；高拷贝和具有强启动子有利于外源基因在真核细胞克隆与表达。（2）昆虫病毒载体：昆虫杆状病毒的衍生物作为载体的优点：可克隆外源DNA片段长度高达100Kb；高表达，外源DNA表达量高达细胞蛋白总量25%以上；安全，仅感染无脊椎动物。（3）植物病毒载体：目前多使用d

27、sDNA 病毒载体，如花椰菜花叶病毒载体。五 人工染色体：利用染色体DNA结构特点构建可携带较大DNA片段的载体称为人工染色体。1 酵母人工染色体yeast artificial chromosome，YAC：是目前能携带最大外源DNA片段的人工构建载体，含有三个必要元件着丝粒、端粒和酵母自主复制序列。由Murray默里1983年构成。YAC含有3个必要元件：着丝粒centromere，CEN可保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子细胞；端粒telomere，TEL位于染色体两末端，可防止染色体在DNA复制过程中两端序列丢失，保证染色体正常复制；酵母自主复制序列ARS，与酵母染色体复制有关。此

28、外还含有限制酶位点和选择标记基因，利用合适的限制酶切开YAC，插入外源基因，导入酵母细胞形成微形染色体，与原有染色体一起复制。YAC自身10Kb，却能携带100-2000Kb外源DNA片段。能保证插入外源基因结构完整性并减少基因库所要求克隆数，故目前YAC已成为构建高等真核生物基因库重要载体。2 细菌人工染色体bacterial artificial chromosome BAC：是第二代大片段DNA克隆载体，是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，可克隆120-300Kb的外源DNA。BAC具有F因子的严谨型控制的复制子，以保证低拷贝数质粒准确分配到子代细胞

29、基因位点，同时含有多克隆位点和遗传标记，通过电穿孔法可将携带大片段外源DNA的重组BCA导入细菌细胞中。此外还有P1因子的人工染色体PAC、哺乳动物人工染色体MAC、人类人工染色体HAC、植物人工染色体PAC等第四节 微生物与基因工程工具酶基因工程所用工具酶绝大多数是从不同微生物中分离的一 限制性核酸内切酶restriction endonuclease 限制性核酸内切酶或简称限制性酶restriction enzyme：能识别双链DNA分子特定序列，并在识别位点中或在其附近切割DNA的一类内切酶。Restriction modification system 限制-修饰体系：限制性核酸内切酶

30、存在于细菌体内，与相伴随存在的甲基化酶（methylase）共同构成细菌的限制-修饰体系，限制外源DNA、保护自身DNA，对细菌遗传性状的稳定具有重要意义。修饰-限制酶命名法：分离菌属首字母+种名前两个字母（如有株名也应加首字母）+罗马数字表示分离出来的先后次序修饰性甲基化酶标以M，限制酶标以R（R常不写）EcoR I E表示大肠杆菌属首字母，co表示种名头两个字母，R表示株名，I表示第一个被分离出来的酶。修饰-限制酶主要由三类：I类和III类无特异性切割故不用于基因工程，基因工程酶中的限制酶即为II类型酶。II型酶的修饰和限制活性由分开的两个酶完成，通常甲基化酶由一条多肽链组成，限制酶由两条

31、相同多肽链组成。识别序列为4-6bp的回文序列（palindromic sequence），甲基化产生5mC、4mC或6mA，对双链DNA作用同类型I一致，限制酶切割部位在识别位点内或靠近识别位点，切割得到5磷酸基和3羟基及黏性末端cohesive end且多为5单链突出黏性末端，3的和平末端blunt end的酶比较少。所有限制酶切割DNA均产生5磷酸和3羟基基团。黏性末端cohesive end：有些限制酶是在DNA两条链识别序列中交错切割形成两个突出的单链互补末端称为黏性末端。如EcoR I和HindIII切割DNA后均形成黏性末端。EcoR I 识别 5-G!AATTC-3 Hpa识别

32、序列为5-GTT!AAC-3平末端blunt end：有些限制酶在DNA两条链上识别序列的对称轴上切割，形成DNA片段具有平末端。二 DNA 连接酶 DNA ligaseDNA连接酶可以将compatible end连接起来，实验室常用T4连接酶以ATP供能，大肠杆菌DNA连接酶以NAD+供能，只能催化黏性末端，故较少使用。实验室常用T4连接酶，其可连接黏性末端和平末端。平末端之间连接反应效率低，可采取以下措施提高效率：提高T4连接酶浓度；提高DNA片段浓度；降低ATP浓度，增强连接酶与DNA结合效率；加入多胺化合物降低DNA静电排斥；加入浓缩剂如PEG等DNA两端若为相容黏性末端（配伍末端）

33、或平末端会发生分子间串联或分子自身环化，这两或称取决于DNA片段的链长与浓度：链短，浓度低，利自身环化，反之，利分子间串联。compatible end 配伍末端：有些限制性核酸内切酶虽然识别序列不完全相同，但酶切DNA后产生相同类型的黏性末端，称为配伍末端或相容末端。其他常用的酶如逆转录酶、DNA pol I、Klenow酶都来自微生物。第五节 外源基因导入宿主细胞一 外源基因与载体体外连接（1）黏性末端连接法（2）接头或衔接物连接法：若外源基因缺乏合适的限制位点，可在外源基因两端加接头（10-12bp组成，具有一个或数个限制酶识别位点的双链寡核苷酸片段），然后限制酶切割，形成黏性末端，再与

34、载体连接；或用衔接物（一端为平末端，另一端为黏性末端）以平末端与外源基因连接，黏性末端与载体连接（3）均聚物加尾法利用末端转移酶，在外源基因两条链3端各加均聚物（A）或（G），在载体DNA的3端加均聚物（T）或（C），两者末端碱基彼此配对，通过DNA连接酶连接。（4）平末端连接法：用T4 DNA连接酶连接。二 克隆载体对宿主基本要求（1）能高效吸收外源DNA：宿主细胞能形成感受态细胞competetent cell，利于宿主吸收外源DNA。（2）不具有限制修饰系统（3）应为重组缺陷型（4）根据载体类型选择相应宿主：如噬菌体载体或黏粒cosmid作为克隆载体时选择噬菌体敏感宿主（大肠杆菌K12菌

35、株）；选用M13噬菌体载体作为克隆载体时，应选择含F因子的雄性大肠杆菌作为宿主。（5）根据载体标记选择合适的宿主如携带氨苄青霉素抗性基因作为选择标记，应选对氨苄青霉素敏感的菌株为宿主；若载体含有-半乳糖苷酶-肽的编码序列，则应选择大肠杆菌-半乳糖苷酶基因N端部分编码序列缺失的突变株lac ZM15，形成互补，便于筛选。（6）具有安全性三 外源基因导入宿主细胞 1 外源基因导入原核细胞（1）转化或转染若外源基因以重组质粒形式存在，可通过转化方式进入原核细胞，若外源基因被构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌粒，可通过转染方式进入宿主细胞。transformation 转化：将外源DNA导入宿主细胞，以

36、改变细胞遗传性状称为转化。transfection 转染：将病毒DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞称为转染。利用CaCl2法处理大肠杆菌细胞处于感受态，从而使外源DNA导入易细胞，这种细胞称为感受态细胞。是迄今应用最广泛的方法。大肠杆菌转化程序：通常先用一定浓度冰冷的CaCl2溶液处理对数期的大肠杆菌细胞，然后加入外源DNA并在42热休克处理90s，使感受态细胞有效吸收外源DNA。一般转化效率可达到酶微克DNA转化107-108个cell2 噬菌体体外包装 该技术1975贝克勒和戈尔德 建立重组噬菌体载体DNA或重组黏粒载体DNA如果大小合适，与噬菌体的头部、尾部和有关包装蛋白混合，集合装

37、配成完整具有感染力的噬菌体粒子。将重组体DNA包装成噬菌体颗粒感染大肠杆菌细（如柯斯质粒载体），在适宜条件下，每微克重组DNA可形成109以上的pfu（噬菌斑形成单位）比感受态细胞转化率高102-103。若将重组DNA通过转染进入大肠杆菌，则微克DNA仅能产生104-105的噬菌斑。说明感染效率高于转染。需要设法阻止包装蛋白与胞内DNA包装，方法有二：其一，从两株各自带有噬菌体缺陷溶原体的大肠杆菌中制备一对互补提取物，这两种提取物分别缺少一种关键包装蛋白，它们单独存在时不会与内源DNA包装，只有在重组DNA存在时二者合并才会发生包装；其二，溶原菌的溶原体cos位点被除去，故可用单一菌株的包装蛋

38、白提取物与外源DNA包装。3 外源DNA导入真核细胞（1）外源基因导入酵母细胞常选择酵母细胞，首先用蜗牛消化酶消化酵母细胞壁制成原生质体；然后在CaCl2和聚乙二醇作用下，重组DNA以转化方式进入酵母细胞原生质体；再将转化的原生质体置于营养琼脂平板上培养，再生出细胞壁。（2）外源基因导入哺乳动物细胞常用且最有效方法之一是electroporation 电穿孔法：采用脉冲高压电瞬间击穿脂双层细胞膜使外源DNA高效导入细胞的方法。用电穿孔仪操作动植物细胞所需电压为数百伏，细菌则需要数千伏。此外利用病毒载体把外源基因导入动物细胞，如把基因插入逆转录病毒载体，然后将其感染靶细胞，使RNA基因组的DNA

39、拷贝整合到宿主细胞染色体中；也可利用重组杆状病毒感染昆虫。（3）外源基因导入植物细胞A 借助根癌土壤杆菌转化植物细胞。将含有Ti质粒的根癌土壤杆菌与纲再生了细胞壁的植物原生质体共同培养，将转化后植株移栽到土壤。此法仅适用于转化双子叶植物，不适于单子叶植物。B 基因枪法或称微弹轰击microprojectite bombardemnt，将外源基因装于直径1微米左右的惰性金属粉末微弹的凹穴内，高速打进靶目标，在植物基因工程中使用较多四 目的克隆的筛选与鉴定通常有3类鉴定方法：载体选择标记鉴定、目的基因序列鉴定、基因表达产物鉴定。1 载体选择标记的鉴定该鉴定比较常用方法有：抗生素抗性选择法、插入失活

40、法、-半乳糖苷酶显色反应法。（1）抗生素抗性选择法如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后重组体细胞置于含有该抗生素培养基平板上培养仍可长出菌落。此外自身环化的载体和未被酶解的载体的转化细胞也能在该平板上生长并形成菌落，而只有作为对照的受体细胞不能生长。此法缺点是假阳性率高（2）插入失活法插入失活insertional inactivation 常用于检测含有目的基因的重组克隆。载体通常携带有氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）若将外源基因插在抗性基因编码序列，将导致相应抗性基因失活，这种外源DNA插入而导致的基因失活现象称为插入失活。如 质粒pB

41、R322的BamH I的位点插入外源基因（破坏了质粒上的四环素基因）转化大肠杆菌（Amps、Tets），含有重组质粒的宿主细胞失去对四环素抗性，故不能在含四环素培养基平板上生长，但仍能在含氨苄青霉素培养基上生长。含有不带外源基因质粒的宿主细胞可在含四环素或氨苄青霉素培养基上生长，故可筛选出含目的基因的菌株。（3）-半乳糖苷酶显色反应选择法某些载体如M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等，载体上都携带lac Z基因的一段，编码-半乳糖苷酶基因的-肽 ，而宿主细胞含有lacZ M15的突变基因，其产物为该酶片段（酶C端）无-半乳糖苷酶活性，但遇到-肽可发生互补作用，产生具有生物活性的酶，

42、使培养基中无色物质X-gal分解，菌落呈蓝色；若将外源基因插入到载体上lac Z的序列，失去-互补作用，结果带有外源基因的菌落呈白色。故可区分。2 目的基因序列的鉴定（1）菌落（噬菌斑）原位杂交细菌菌落或噬菌斑的原位杂交法（即molecular hybridization分子杂交法）：利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。大致过程：将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落（或噬菌斑）后，将硝酸纤维素滤膜贴在平板上，使菌落（噬菌斑）转印到滤膜上，翻转滤膜并置于另一不含菌的平板上，经培养后滤膜上可长出菌落或噬菌斑。用碱液处理滤

43、膜，使菌体裂解，释放出DNA并被变性；再经烘烤，变性DNA固定于滤膜上。然后将滤膜和放射性探针标记的核酸探针溶液装在密封的塑料袋内进行分子杂交。放射自显影后，含有与探针互补的DNA菌落在X线底片上呈现黑色斑点。通过与原平板上菌落位置对照即可挑选出韩目的基因的克隆。此法优点为可在短时间内从成千上万的克隆中筛选到阳性克隆。也存在非放射性的探针，例如在探针上偶联能产生颜色反应的酶或偶联发光物质。杂交筛选的关键是获得特异性探针，探针一般要大于16个核苷酸，可以是单链DNA、RNA或双链DNA：可人工合成；可参考目标基因同源序列做探针；若已知蛋白序列或部分序列，可按照密码子简并性合成简并探针degene

44、rate probe（2）限制性酶图谱初步筛选获得阳性克隆进行小量培养后，提取重组质粒，然后用合适内切酶进行酶切，电泳，检测插入外源DNA长度或限制酶图谱是否与预期一致。（3）DNA序列测定对含目的基因克隆的DNA进行测序3基因表达产物的鉴定（1）免疫活性测定 放射性标记抗体，通过放射自显影检测；或酶与抗体偶联，通过显色反应检测。（2）生物活性测定 若是酶可测酶活，若是酶抑制剂可测其对酶活抑制能力。（3）氨基酸序列测定 水解表达产物的肽谱第六节 外源基因在细菌中的表达克隆载体cloning vector 主要能携带外源基因并具有复制起始序列，以保证外源基因在宿主细胞中进行有效扩增表达载体exp

45、ression：除了能携带外源基因、含有复制起始序列外，还必须含有宿主细胞基因表达所需的调控序列，确保外源基因在宿主细胞进行高效转录、翻译产生大量基因产物。原核与真核生物基因表达调控机制由许多不同：1 真核生物的启动子不能被原核细胞的RNA聚合酶所识别；2真核生物基因含有内含子，原核细胞缺乏将它们转录物进行拼接加工的机制；3 真核生物mRNA上没有SD序列，因此不能与原核细胞的核糖体结合；4真核生物的基因产物往往需要翻译后加工，原核细胞缺乏有关加工的酶；5真核生物基因表达后的蛋白易被原核细胞蛋白酶所降解。故真核生物的cDNA必须置于原核细胞的启动子、SD序列、终止子等调控下，才能在其细胞内表达

46、。一 外源基因的转录1 启动子原核细胞表达外源基因常用5种启动子：lac启动子，乳糖操纵子的启动子，受lac I编码的阻遏蛋白调控；trp启动子，Trp操纵子的启动子，受trp R编码的阻遏蛋白调控；tac启动子，由lac启动子的-10区和trp启动子的-35区融合而成，是一个强杂合启动子，受lac I阻遏蛋白调控；PL、R启动子，是噬菌体左、右向启动子，温度敏感的阻遏蛋白控制；T7噬菌体启动子，非常强的启动子，只被T7 RNA聚合酶识别。2 转录的调节和控制理想的培养方式：培养早期，外源基因不进行转录，宿主细胞迅速生长直至获得足够量细胞；然后打开外源基因转录开关，使所有细胞的外源基因同时高效

47、表达，产生大量有价值基因表达产物。基因工程常用3种转录调控方式：诱导物诱导，温度诱导、RNA聚合酶调节。（1）诱导物诱导无诱导物时细胞大量生长，加入诱导物，打开转录开关，启动外源基因转录。如：lac UV5启动子（lac启动子经紫外线诱变，使其活性无需cAMP激活）构建的表达载体，无诱导物时，lac I 基因产生阻遏蛋白与lac 操纵区O结合，阻断外源基因转录，细菌大量繁殖；加入诱导物IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）后，诱导物与阻遏蛋白结合，使之构象改变不能与操纵区结合从而启动外源基因表达。（2）温度诱导温度敏感突变株表达外源基因时，30，细胞大量生长，42时打开转录开关，启动外源基因转录

48、。如 噬菌体PL、R启动子构建表达载体时，其温度敏感突变株30时cI基因产生有活性阻遏蛋白与操纵区结合，组织外源基因转录，细菌大量生长；42时，阻遏蛋白被钝化，解除阻遏，启动外源基因高效表达。（3）RNA聚合酶调剂噬菌体T7启动子仅能被T7 RNA聚合酶识别，该聚合酶与该启动子一同插入质粒，该酶的转录可受lac启动子或启动子控制。宿主细胞长到足够数量后，加入诱导物或升温，启动T7RNA聚合酶表达，进而启动T7启动子，启动外源基因表达。由于T7启动子/T7 RNA聚合酶系统非常强，致使宿主正常基因完全不能转录，导致宿主停止生长。3 转录终止子terminator：指一段位于基因或操纵子的3端，具

49、有终止转录供能的特定DNA序列。可阻止整个载体转录，保证mRNA稳定性。若合成mRNA过长，不仅消耗细胞内底物和能量，且易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。二 外源基因的翻译1 核糖体结合位点ribosome-binding site，原核生物遗传信息的翻译起始于mRNA上的核糖体结合位点，特别是SD序列。真核生物的mRNA上没有SD序列，当原核细胞表达真核基因时，真核基因必须置于原核细胞SD序列之下。SD 序列Shine-Dalgarno sequence：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌

50、16S rRNA 3端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。核糖体结合位点ribosome-binding site ：mRNA的起始AUG上游约813核苷酸处。存在一段由49个核苷酸组成的共有序列-AGGAGG-，可被16SrRNA通过碱基互补精确识别。这段序列被称为核糖体结合位点。2 密码子偏爱性 biased codons 偏爱密码子：由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子，在基因组中高频出现的密码子称为偏爱密码子，通常对应丰富的tRNA。出现频率低的tRNA密码子称为稀有密码子 rare codons。不同生物对各种密码子使用频率不同，真核生物使用频率高的密码子可能在原核细胞中很少被

51、用。在原核细胞中表达真核基因和根据原核生物密码子的使用类型对真核基因进行适当基因突变改造，以便其得到高效表达。3 终止密码子终止密码子的终止功能也能影响mRNA的翻译效率，故为了提高外源基因转录产物翻译效率通常选择强的终止密码子，UAA最强。琥珀密码子amber codon：指mRNA的多核苷酸链中的终止密码子（UAG），它引起蛋白质翻译的中止。赭石密码子ochre codon：信使核糖核酸(mRNA)分子上三种终止密码子之一，是终止密码子UAA的特异性名称。三 外源基因表达产物1 非融合蛋白表达 unfused protein expression：指外源蛋白不与宿主蛋白融合，自身单独表达。

52、非融合蛋白表达载体是将带有起始密码子AUG的真核基因插入到合适的原核细胞启动子和SD序列下游，经转录翻译就可在原核细胞中表达。非融合蛋白表达之优点是可直接产生天然外源蛋白，缺点是易被细菌胞内蛋白酶降解。可采用胞内蛋白酶含量低的大肠杆菌突变株作为表达宿主，或利用胞内蛋白酶抑制剂，或将外源蛋白分泌到胞外等方法防止外源蛋白被降解。2 融合蛋白表达 fused protein expression：指表达产物是外源蛋白与宿主蛋白结合而形成的杂合蛋白。其载体是将外源细胞操纵子的起始部分（包括启动子、操纵基因、核糖体结合部位和原核基因N端序列）与外源基因的编码序列连接，并使其阅读框架保持一致，以保证所翻译

53、外源蛋白正确性。如 将外源基因插入麦芽糖结合蛋白基因（mal E gene）的可阅读框架内，该融合蛋白基因可在tac 启动子的控制下表达融合蛋白。将含有融合蛋白序列的表达载体导入大肠杆菌后，外源基因与mal E基因被一起转录和翻译产生融合蛋白（麦芽糖结合蛋白-蛋白酶裂解位点-外源蛋白）然后用一种特殊的蛋白酶（凝血因子Xa）将融合蛋白与前两部分分开即可获得外源蛋白。（与ExC项目思路一致）融合蛋白表达优点是可获得高效表达，这是由于AUG后大约20个核苷酸对翻译有较明显的影响，而融合蛋白的N端总是选择天然存在的高表达的宿主蛋白，其mRNA具有较强翻译能力；融合蛋白在细胞内也比较稳定，含有宿主蛋白N

54、端序列可保护自身不被降解；许多融合蛋白可作为抗原。缺点是后期处理加工比较麻烦。从融合蛋白中分离目标蛋白可采用酶法或化学法。酶法：可在细菌蛋白和外源蛋白之间加入一段可被蛋白酶识别的AA序列，然后用蛋白酶水解。例如凝血因子Xa识别并裂解特异序列Ile-Glu-Gly-Arg。化学法：可在外源蛋白与细菌蛋白之间加入Met，然后用CNBr裂解Met。3 外源蛋白分泌表达分泌性表达载体额外需要将信号肽的编码序列和外源基因连接，以便信号肽和外源蛋白融合，信号肽携带外源蛋白越膜分泌到细菌周质或胞外，然后膜上信号肽酶将信号肽切除，释放有活性外源蛋白。4 包涵体 inclusion body：当外源蛋白在大肠杆菌中高水平表达时，在细胞质内长积累大量难溶的、非正确折叠的、无生物活性的外源蛋白称为包涵体。包涵体形式有利于外源蛋白高水平表达，可防止蛋白酶对外源蛋白降解，也可避免外源蛋白对宿主细胞毒害作用。通常细胞经破壁和差速离心后可得到包涵体沉淀，然后进行变性和复性处理，外源蛋白经正确折叠后成为可溶性、有生物活性的蛋白。许多情况下，基因工程菌种每