第03章层析技术dun1

1、第三章第三章 层析技术层析技术 chromatography technology第三章第三章 层析技术层析技术21222112wwywwvrvrrs 洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。 流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。 总之，我们必须经过反

2、复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。 凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。层析过程如图 所示。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗

3、粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 gel structureagarosea good gel for gel filtration contains about95% watergel structureagarosedextrana hypothetical structure for superdexsteric exclusion

4、molecules are excluded from the gel bead to different extents according to their sizesgel beadvery large molecules are completely excludedvery small ones get everywhere5.3 凝胶层析的基本概念凝胶层析的基本概念5.3.1 外水体积、内水体积、基质体积、柱外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积床体积、洗脱体积5.3.2 分配系数分配系数5.3.3 排阻极限排阻极限5.3.4 分级分离范围分级分离范围5.3.5 吸水率和

5、床体积吸水率和床体积5.3.6 凝胶颗粒大小凝胶颗粒大小 外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为vt，外水体积为vo，内水体积为vi，基质体积为vg，则有：vtvovivg 由于vg相对很小，可以忽略不计，则有：vtvovi 设洗脱体积为ve，ve一般是介于vo 和vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积vevo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积vg），故其洗脱体积vevt。分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。有时可能会出现ve vt，这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。凝胶层析中的几种洗脱峰如图 所示： ）凝胶的床体积（）柱床体积（）干胶用量（g/mlmlg 111what happens in ion