基因工程的基本操作程序教学PPT学习教案

1、会计学1基因工程的基本操作程序教学基因工程的基本操作程序教学抗虫棉的培育的过程：第1页/共49页基因表达载体的构建第2页/共49页第3页/共49页补：原核细胞的基因结构编码区下游 非编码区非编码区编码区编码区上游 启动子终止子补：真核细胞的基因结构内含子 外显子 编码区非编码区非编码区启动子终止子编码区上游 编码区下游 RNA聚合酶的始结合位点RNA聚合酶的末结合位点第4页/共49页结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子： 外显子： 第5页/共49页基因文库 基因组文库部分基因文库（cDNA文库）u基因文库中不是直接保管

2、相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。第6页/共49页基因组文库的构建模式图第7页/共49页部分基因文库的构建模式图第8页/共49页小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以第9页/共49页解旋酶催化1)解旋模板2)合成互补子链 以母链为模板进行碱基配对(在DNA聚合酶的催化下,利用游离的脱氧核苷酸进行)母链（旧链）子链（新链）子代DNA:同时进行(边解旋边复制)组成3)形成新的DNA分子作用：把单个脱氧核苷酸连接成链(形成磷酸二酯键)第10页/共49页2.利用PCR

3、技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。 2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列第11页/共49页PCR技术的操作过程a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。 氢键单链DNA双链DNA链d.重复步骤：每重复一次，目的基因增加_倍一第12页/共49页PCR技术的操作过程第13页/

4、共49页PCR技术的操作过程第14页/共49页PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等第15页/共49页n 过程：变性、退火、延伸三步曲 变性：9095 退火：5560 延伸：7075第16页/共49页3. 人工合成法利用DNA合成仪人

5、工合成的前提：基因较小，核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？第17页/共49页课堂小结1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库归纳：获取目的基因的方法第18页/共49页思考：为什么要构建基因表达载体？（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。二、构建表达载体第19页/共49页作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务

6、吗？ 不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 第20页/共49页2.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因第21页/共49页启动子：终止子：标记基因：位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。位于基因尾端的一段特殊的DNA片段，能终止mRNA的转录。鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。第22页/共49页相同点：不同点：思考：载体与表达载体的异同都有标记基因和复制原点。表达载体在载体基础上增加了目的

7、基因、启动子、终止子三部分结构。第23页/共49页基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶切割两个切口获得目的基因DNA连接酶连接重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端用同一种限制酶分别切割目的基因个质粒，使之露出相同的粘性末端，并用DNA连接酶使之连接 第24页/共49页三、将目的基因导入受体细胞（一）转化： 目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定表达（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞第25页/共49页第26页/共49页（1）农杆菌转化法特点： Ti质粒上

8、的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。第27页/共49页转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌第28页/共49页 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法第29页/共49页（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因

9、借助花粉管通道进入受体细胞。第30页/共49页第31页/共49页（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到输卵管或子宫受精卵发育新性状动物第32页/共49页常用法：常用菌：微生物作受体细胞原因：过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少第33页/共49页受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞小结：将目的基因导入受体细胞

10、第34页/共49页 四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？12目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？ 第35页/共49页第36页/共49页转基因生物的DNA探针15151414方法DNA分子杂交技术（DNA与DNA）1、检测分子水平的检测第37页/共49页方法DNA与mRNA杂交技术探针1515转基因生物的mRNA14141、检测分子水平的检测第38页/共49页1、检测分子水平的检测提取苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质 出现杂交带脱分化组织培养第39页/共49页（二）鉴定（个体生

11、物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等第40页/共49页类类型型步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示分分子子检检测测第一第一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入受体细胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第二第二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带

12、个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。否相同等。第41页/共49页第42页/共49页课堂练习1、有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A第43页/共49页课堂练习2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.D第44页/共49页课堂练习第45页/共49页课堂练习【拓展深化】只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个