反义c-myc对MCF-7细胞hTERT基因表达抑制作用的研究

1、泸州医学院硕t学位论文反义c-myc对mcf-7细胞htert基因表达抑制作用的研究 姓名：马莉申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学（遗传）指导教师：税青林20040501反义c-myc对mcf-7细胞htert基因表达 抑制作用的研宄摘 要目的：研究脂质体lipfectaminetm （lr）介导的c-myc反义寡核苷酸（asodn）对mcf-7细胞端粒酶催化亚单位htert基因表达的抑制 效应，进一步阐明c-myc对htert基因的调控作用，并为针对端粒酶活 性抑制的乳腺癌的基因治疗提供理论依据。方法：培养mcf-7细胞，待细胞生长状态良好并达到指数生长期时，根据所购脂质体的厂家推荐

2、剂 量，按照每孔脂质体200（11，寡核苷酸500gl的剂量配成转染复合物，加 入各孔细胞中。研宄设置对照组、lr-sodn组及lr-asodn组，每组6 个复孔。在转染24小吋、48小吋、72小吋后，分别收集各组细胞，用 uniq柱式trizol提取法提取各组总rna,按mmlv 一步法pcr （略 作改进）进行htert mrna表达的检测，紫外凝胶成像分析仪进行凝胶 电泳产物的灰度扫描，以htert与内对照引物（3-肌动蛋白（3-actin）的 比值表示htert mrna相对表达量。实验重复5次。数据进行单因素方 差分析，ct=0.05。结果：1.1.2%变性甲醛琼脂糖凝胶电泳分析rn

3、a提取样品显示28s和18s两条清晰带，前者的质量是后者的2倍，表明rna 提取成功，提取样品可用作rt-pcr的扩增模板。2.rt-pcr扩增产物 凝胶电泳分析显示：各组在puc mix marker 145bp处均可见明暗不一的 htert扩增条带，于540bp处可见明暗一致的p-actin扩增带；3.凝胶灰 度扫描以htert和内参照引物p-actin的灰度比值表示htert mrna相 对表达量。对照组的5组htert mrna相对表达量分别为0.705、0.713、 0.753、0.724 和 0.733； lr-sodn 组 24 小吋的 5 组 htert mrna 相对表达量分

4、别为 0.704、0.714、0.750、0.724 和 0.731； 48 小时的 5 组 htert mrna 相对表达量分别为0.703、0.713、0.747、0.726和0.730； 72小时的5组 htert mrna 相对表达量分别为 0.699、0.716、0.742、0.719 和 0.730； lr-asodn组24小时的5组htert mrna相对表达量分别为0.589、0.612、0.538、0.614 和 0.701; 48 小吋的 5 组 htert mrna 相对表达量 分别为 0.289、0.218、0.274、0.265 和 0.254； 72 小时的 5 组

5、 htert mrna 相对表达量分别为0.148、0.136、0.131、0.159和0.143。单因素方差分 析显示，lr-asodn作用于mcf-7细胞24、48、72小吋吋htert mrna 相对表达量分别与lr-sodn、对照组相比有显著性差异（p<0.01），lr- sodn作用于mcf-7细胞24、48、72小时时htert mrna相对表达量 分别与对照组相比无显著性差异（p0.05）。并且asodn对mcf-7细胞htert基因的抑制效果随时间推移而逐渐升高。结论：1.lr介导的c-myc asodn能冇效抑制mcf-7细胞中端粒酶htert mrna表达水平， 且抑

6、制效果随着时间的延长逐渐明显。木研究通过抑制htert的促进因 素一c-myc来改变htert活性，从逆向的角度进一步证明c-myc x寸htert 基因表达具有正向调节作用；2.结合继往c-myc asodn能有效抑制 mcf-7细胞的生长及其c-myc蛋白表达的研究结果，推测艽机制为：lr 介导c-myc asodn通过封闭c-myc基因抑制其蛋白表达，下调htert 基因表达，进而丁调端粒酶活性，使细胞生长受到抑制。3.通过c-myc 反义寡核苷酸封闭c-myc基因表达，下调htert基因表达水平，降低端 粒酶活性，是一条可行性的肿瘤治疗策略。关键词c-myc基因；反义寡核苷酸；hter

7、t；逆转录pcr （rt-pcr）study on the inhibitive effect of liposome-mediated c-mycantisense oligonucleotide on telomerase activity and htertgene expression of mcf-7 cellsabstract： objective: the purpose of this study was to investigate the inhibitive effect of liposome (lipfectaminetm，lr)-mediated c-myc ant

8、isense oligonucleotide (asodn) on human telomerase reverse transcriptase (htert ) gene expression of mcf-7 cells. and to provide experiment testimony for the gene therapy of galactophore cancer, whose aim is to inhibitate telomeraseactivity. methods: cultivated mcf-7 cells in the ordinary culture pl

9、ates for 10 days. the culture before and during transfection went on in the six-hole plates. transfective complex consisted of lipfectaminetm 200 and oligonucleotide 400|il. the total rna samples of c-myc groups，sodn groups and asodn groups were distracted by uniq-10 column trizol total rna distract

10、 kit in 24 hours，48 hours，72 hours after transfection. the assay of htert active expression was detected by mmlv one step rt-pcr kits. mrna relative expression was valued by the comparison of htert and p-actin gray degree. this experiment repeated three times. the statistical method was used to comp

11、are and analyse the data of three groups to see if there were some statistical differences between them. results: 1. the total rna of three groups was distracted with the purity (a260/a280) is 1.72.1. the integrality of total rna was identified . under the ultraviolet lamp, 28s bond and 18s bond wer

12、e seen distinctively. besides，the mass of the former was two bigger than the latter, which showed rna was intact. 2. every group saw htert duplicate products atpuc mix marker 145 bp，and the same duplicate products of p-actin at 540bp. 3. the gray degree were received by scanning these duplicate prod

13、ucts under ultraviolet lamp. the values of htert mrna relative expression in control group were 0.705、0.713、0.753、0.724 and 0.733 repectively. the values of lr-sodn group in 24 hours were respectively 0.704、0.714、0.750、0.724 and 0.731; in 48 hours were respectively 0.703、0.713、0.747、0.726 and 0.730;

14、 in 72 hours were 0.699、0.716、0.742、0.719 and 0.730. the values of lr-asodn group in 24 hours were 0.589、0.612、0.538、0.614 and 0.701 ； in 48 hours were 0.289、0.218、0.274、0.265 and 0.254； in 72 hours were 0.148、0.136、0.131、 0.159 and 0.143.4. statistics analyses showed the differences of htertmrna re

15、lative expression values between lr-asodn group and control group， lr-sodn group had apparently statistical meaning (p<0.01). but thedifferences of control group and lr-sodn group had unconspicuous statistical meaning (p>0.05). conclusion: lipfectaminetm-mediated asodn could effectively inhibi

16、t the active expression of htert mrna in mcf-7 cells. themechanism for this study was conferred that: lr-mediated c-myc asodn occluded c-myc gene，inhibited c-myc protein expression，down-regulated htert genic expression activity，depressed htert mrna expression，reduced telomerase activity，and inhibite

17、d the cell growth at last.key words: c-myc gene; antisense oligonucleotide;human telomerase reverse transcriptase (htert);reverse transcription-polymerase chain reaction (rt-pcr)英汉缩略名词对照表英文缩写英文全称中文译名asodnantisense oligonucleotide反义寡核苷酸bpbase pair碱基对depcdiethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯dmsodimethyl sulphox

18、ide二甲基亚砜ebethidium bromide溴化乙锭fbsfetal bovine scrum胎牛血清hterthuman telomerase reverse transcriptase 人i耑粒酶反转录酶htrhuman telomerase rna人端粒酶rnalrliposome脂质体mops3-(n-morpholino) propanesuofonic acid 3-（n-吗啉代）丙磺酸mrnamessage ribonucleic acid信使核糖核酸mttcolorimetric. 3-(4,5-dimethylthiazd-z-yl)-2,5-dithenyl tet

19、razolium bromide四甲基偶氮唑盐odnoligonucleotide寡核苷酸pcrpolymerase chain reaction多聚酶链反应rnaribonucleic acid核糖核酸rpmrates per minute每分钟转速rt-pcrreverse transplicate-pcr反转录pcrsodnsense oligonucleotide正义寡核苷酸tptelomerase-associated protein端粒酶相关蛋白traptelomere repeated application protol端粒重复扩增序列端粒酶是由rna和蛋白质组成的核糖核酸蛋白

20、酶复合体，是一种依 赖于rna的dna聚合酶。它能以自身携带的rna为模板合成新的端粒dna序列并添加到染色体末端，防止端粒缩短，使细胞获得无限增殖的 能力，即不死性。大量的研究表明tl，2，几乎所有恶性肿瘤组织中端粒酶 都高表达，而良性病变或正常组织中无表达。近来组成人端粒酶复合物的三个主要成分己被鉴定，rna成分（htr）提供了端粒重复序列合成的模 板pb端粒酶相关蛋0（tp1）可能作为一个调节亚基介导端粒酶与其它分 子相结合；最重要的一种成分端粒酶的催化亚基（htert） 4,被认为是端粒酶激活的限速因素，80%-90%的人类肿瘤表达hterto htert活性 的上调是端粒酶激活的主要

21、途径5,6,7】，随着htert基因克隆成功，htert 的调控研宄成为端粒酶研宄的重点。目前的研究己表明 htert的调控主要在转录水平上进行，而c-myc 是第一个被发现的调节htert基因表达的重要转录因子。c-myc基因是禽 类髓细胞病毒（amn） mc-29的v-myc的细胞同源序列，由myc原癌基 因编码，参与细胞的分化与增殖，其调控表达异常与肿瘤发生密切相关。olnw报道，与正常细胞相比，myc蛋白在肿瘤细胞中表达显著 增高；激活或抑制myc蛋白表达可以改变htert启动子活性，认为myc蛋白对htert启动子的调节作用可能与其促进肿瘤形 成有关。sangtaek等【11 应用c

22、-myc反义核酸作用hela细胞，发现c-myc和htert基因表达均下降且两若呈平行关系。表明了 c-myc和htert之间的密切关系。乳腺癌是威胁女性的常见恶性肿瘤之一。本实验室曾在端 粒酶活性表达和乳腺癌关系研宂屮，发现癌组织屮端粒酶阳性 表达率为90.38%12，定量研宂亦证明端粒酶确实是乳腺癌的特异 性标记物h。并且，通过脂质体lipfectaminetm介导反义c-myc寡核苷酸转染mcf-7细胞，发现c-myc反义寡合苷酸可显著抑 制mcf-7细胞的生长。本研究选用c-myc, htert和端粒酶均 高表达的乳腺癌mcf-7细胞，采用lipfectaminetm介导的反义核酸技术

23、转染细胞，通过抑制htert的促进因素一 c-myc基因表达研究mcf-7细胞中htert基因表达的变化，从逆向的角度研究封闭c-myc基因对mcf-7细胞的htert基因表达 抑制的影响，进一步探讨c-myc对htert基因表达的调控作用，阐明反义c-myc对mcf-7细胞生长抑制的机制，也为乳腺癌的 基因治疗提供新的理论依据。材料和方法1 实验材料和试剂1.1 细胞株人乳腺癌的mcf-7细胞株：购自中科院上海细胞生物研究所细胞库1.2 主要实验试剂脂质体 lipfectaminetm reagent (lr): invitrogen(高糖)dmem 培养基：gibco brl co新生小牛

24、血清(fbs):成都哈里生物工程有限公司hepes: sigma胰岛素：诺和诺德公司产品胰蛋白酶:gibco brl co二甲基亚砜(dmso): sigma焦碳酸二乙酯(depc):上海生物工程有限公司puc mix marker: sangonrna marker 18s&28s: sangonuniq-10柱式trizol总rna提取试剂盒：上海生物工程有限公司 mmlv 一步法rt-pcr扩增试剂盒：上海生物工程有限公司2 主要实验仪器coz恒温培养箱：shellab无菌超净工作台：上海净化设备厂倒置相差显微镜：重庆，xsj-d 低速离心机：北京医用离心厂ldz5-2型 高速离

25、心机：centrifuge 5417r/14000r/s, eppcndorf 电子分析天平(es-j型)：沈阳龙腾电子称量仪器冇限公司 pcr 仪：thermal mastercycle gradient，eppendorf紫外凝胶成像分析系统:whitc/ultraviolct trasilliominator, olympia培养瓶，培养板（6孔板），1.5ml离心管，0.2ml eppendorf管 3实验方法3.1寡核钍酸（odn）的合成和序列根据人类c-myc基因第二外显子翻译起始区序列设计正反义寡核苷酸序列，由上海sangon公司合成并行全硫代磷酸化修饰。经计算机网上 检索证实与

26、人类其他已知基因无同源性。序列分别为：反义序列（asodn） : 5'-aacgttgaggggcat-3'正义序列（sodn） : 5'-atgcccctc aacgtt-3'3.2 pcr引物合成和序列htert基因pcr扩增引物参照takakura等的方法，并经genbank 检索证实，htert 上游引物序列：5'-cgg aag agtgtctgg agc aa- 3' htert 下游引物序列：5'-ggatga agcggagtctgg a-3'，扩增 片段长度为145bp。内对照p-肌动蛋白（p-actin）基因上

27、游引物：5'-gtgggg cgcccc aggcacca-3' p-actin 下游引物序列：5'-gtc ctt aat gtc acgcacgatttc-3'，扩增片段长度为540bp。上述引物均由上海sangon 公司合成。3.3乳腺癌mcf-7细胞培养、传代、冻存和复苏3.3.1培养液的配制dmem 培养基：高糖 dmem 干粉 13.4g, nahcoa 1.38g, hepes 2.0g, 溶于1000ml三蒸水中，搅拌至完全溶解，调ph值至7.0，经0.22pm微孔滤膜过滤除菌，取200ml分装成2个100ml瓶，余800ml培养基分别加 入双抗

28、，即青霉素和链霉素（均为loouj/ml）。按95ml和90ml分装，-20 °c保存。用前取出培养基解冻，95ml瓶加入fbs 5ml, 90ml瓶加入fbs 10ml,使fbs终浓度分别为10%和5%，同时加入胰岛素（0.5ml/100ml），4 °c保存。以上操作均在无菌条件下进行。下文中提到的培养基，如无特殊说明，均指含5%fbs的dmem。mcf-7细胞的传代用0.25%胰蛋白酶消化培养细胞，当细胞变圆、收缩时，加入hanks 平衡盐溶液终止消化，吹打细胞至完全分散为单细胞悬液，1500转/分离心5分钟，吸弃上清液，培养基定容后计数细胞，按比例加入培养液稀释 至1

29、x105个/ml,转种于培养瓶。每日于倒置相差显微镜下观察细胞生长 情况并注意培养基颜色变化、有无浑浊，根据情况及时更换培养液或传代。mcf-7细胞的冻存和复苏用0.25%胰蛋白酶消化培养细胞，当细胞变圆、收缩时，加入hanks 平衡盐溶液终止消化，吹打细胞至完全分散为单细胞悬液，1500转/分离 心5分钟，吸弃上清液，加入1份dmso和9份不含胰岛素的5%fbs的 dmem,吹打混匀，转吸入各1.5ml冻存管，密封管口，做好标记，置于- 70°c保存。一周后从-70°c中取出一只冻存管，迅速置于37°c水浴箱中，轻轻振荡至冻存液完全溶解，75%酒精消毒管口，将冻

30、存液吸入10ml无 菌试管屮，加入hanks液至9ml混匀，1500转/分离心5分钟，弃去上清 液，再重复离心一次，弃去上清液，加入dmem培养基适量，反复吹打均匀后转入无菌培养瓶中，37°c、5%co2恒温培养箱中培养，观察见细胞 正常生长，表明复苏成功，即将其余几只冻存管直接浸入液氮保存。3.4mcf-7细胞的转染3.4.1转染细胞的准备lr介导的odn对mcf-7细胞的转染在6孔板（106个细胞/孔/2ml培养棊）上进行。将细胞分为对照组、lr-sodn组与lr-asodn组，每 组6孔，即1个6孔培养板为1组。在转染的前一日接种2x105个/ml指数生长期的细胞于每孔中，当细

31、胞融合度达80%时用无血清、无双抗的 dmem培养基快速洗涤细胞2次后备用。3.4.2转染复合物溶液的配制及基因转染lr溶液配制在聚苯乙烯材料的试管中进行，每组每孔lr剂量为 200)11，并以每孔500gl的总量用无血清、无双抗的dmem培养基稀释， 分别配制各组lr溶液即a液。c-myc odn按说明先用消毒三蒸水配制成 浓度为40)lim的溶液，再以无血清、无双抗的dmem培养基稀释配制成 浓度为lopm的c-myc odn溶液即b液。将b液以每孔500)li1的量分别 加入三组的a液中，混合均匀后，于室温中静置20分钟，使之形成odn/lr 转染复合物，继以每孔2000)li1 (2m

32、l)的总量补加无血清、无双抗的dmem 培养基稀释并充分混匀。然后将转染稀释液以每孔2ml分别滴加于相对应 的前述洗涤后培养细胞上。各组各孔lr最终浓度均为10%, c-myc odn的最终浓度均为2.5im；对照组细胞只加同量培养基。置于37'c、5%co2 恒温箱中培养5h后，每孔补充加入10%fbs的dmem完全培养液2ml。继 续培养。3.5 uniq-10 柱式 trizol 法提取总 rna3.5.1提取前准备在倒镜显微镜下观察，待对照组细胞铺满细胞培养板的底面时，吸 弃各孔培养液，pbs洗涤后，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，当细胞形态 由梭形或不规则形贴壁变为皱缩圆形的

33、悬浮细胞后，加入hanks液终止消 化，将同组的各孔细胞悬液收集至同一普通离心管中，l，200rpm室温离心 5分钟，去上清液。向各管再加入hanks液，吹打成细胞悬液，经过适当 稀释后，在普通光镜下行细胞计数。若各组细胞数量21x107个，将各管细胞悬液转移到相应的已用depc-hzo处理、无菌的1.5ml离心管中， 5,000rpm室温离心后，去上清。3.5.2总rna提取每1x107个细胞加入0.5mltrizol,用枪头反复抽吸混匀。1ml针筒、 26-g号(6/0针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组dna,然后直接从针筒 屮将上述匀浆液转移到无菌的1.5ml离心管屮。加入100ml氯仿/异

34、戊醇（24:1），剧烈振荡混匀30s后，12,000rpm室温离心5min。将上清液（约 450|il）小心转移到无菌的rnase-free 1.5ml离心管屮，加入150（lu无水乙 醇，混匀。将溶液全部转移到套放于收集管内的uniq-10柱中，室温放置 2min, 6,000rpm室温离心lmin。小心取出枯，弃去收集管中的废液，将 柱放回收集管屮，加入450|li1 rpe solution, 10,000rpm室温离心30s，弃 去收集管中废液，再重复以上操作一次。小心取出柱，放到无菌的rnase-free 1.5ml离心管中，在柱中央小心加入50（il depc-h2o,室温放置2m

35、in, 10,000rpm室温离心lmin。离心管内的溶液为rna样品，可直接使用或 用去离子甲酰胺溶液溶解并贮存于-20°c。3.5.3 rna制品浓度及纯度检测rna的浓度及纯度均通过紫外分光光度计测定。测定前，石英杯以去离子水洗3次，每次洗完后甩干用5%hc1浸泡过夜，双蒸水洗浄备用。注意石英杯不能用碱泡（因二氧化硅可以与强碱反应生成硅酸钠，腐蚀石英杯）。吸4gl rna样品，力卩depc处理水至1ml混匀，移入分光光度计的石英比色杯中，分光光度计先用1 ml depc水校正零点，在260nm和280nm分别读出核酸的光密度。rna样品浓度为：od26（）x稀释倍数x 40/1

36、000,单位ig/gl；以样品在260nm和280nm的紫外线吸收值的比（a260/a280）确定核酸的纯度。3.5.4rna样品质量检测准备一个特定的电泳仪专门用作rna样品的分析。用水清洗电泳仪和梳子，乙醇擦干，然后用3%的h2o2溶液填充，室温下浸泡1530分钟， 最后用0.1%depc处理过的水彻底冲洗电泳槽和梳子。配制10x甲醛凝 胶电泳加样缓冲液、loxmops电泳缓冲液（配方见表1）,溴化乙锭用depc 处理的水配制成200pg/ml。制备100ml含有2.2mol/l甲醛的1.2%的琼脂 糖凝胶，加1.2g琼脂糖到72ml灭菌水中，用微波炉煮沸法溶解琼脂糖， 将溶液冷却到55&

37、#176;c同时加入10ml loxmops电泳缓冲液和18ml去离子甲醛在化学通风橱内灌制凝胶，用一个3mm的梳子打孔。表1甲醛变性琼脂糖凝胶缓冲液配方table 1. dispensation of 1.2% formaldehyde agarose gel buffer10x甲醛凝胶电泳加样缓冲液loxmops电泳缓冲液50%甘油0.2mol/l mops (ph 7.0)(稀释于depc处理过的水屮)20mmol/l乙酸钠lommol/l edta (ph 8.0)lommol/l edta (ph 8.0)0.25%溴酚蓝().25%二甲苯腈蓝乙酸在一灭菌的微量离心管屮建立变性反应：

38、rna2.0gl, loxmops电泳 缓冲液2砌1，甲醛4.0gl,甲酰胺10.01,溴化乙锭l.oglo盖紧微量离 心管的盖子，丁* 55°c温行rna液体60 min,在冰水中冷却样品10 min,然后离心5s并将所有的液体在微量离心管的底部沉淀。加2gll0x甲醛凝 胶电泳加样缓冲液并将试管重新置于冰上。将琼脂糖/甲醛凝胶装入水平电 泳梢中，加入足够lxmops电泳缓冲液覆盖凝胶约1mm。电泳5 min (5v/cm)。加rna样品到凝胶加样孔中。在紫外灯下观察，28s和18s两 条带清晰可见。且前者的质量是后者的2倍，表明rna没有降解(图1)。 3.6rt-pcr3.6.

39、1扩增反应将各管rna祥品及反应液置于冰上，一切加样操作均在冰上进行。在501反应体系中，加入lgg模板rna, 2x反应混合液25gl, mmlv/taq mix lgl, htert上下游引物均lpl，内对照p-actin基因上下游引物均0.3gl, 加无菌双蒸水至 50|il，37°c 30', 94°c 2 94°c 15", 57°c 30"，68°c 90"，35个循环，最后68°c 5'。3.6.2凝胶电泳及成像分析配制loxtbe电泳缓冲液（ph 8.0）、6x样品缓冲液（

40、配方见表2）。 称取琼脂糖，按照1.7%的浓度溶解在0.5xtbe电泳缓冲液中，置于水浴 锅加热，至琼脂糖熔化均匀。用玻璃胶带将电泳槽四周封好，然后在凝胶 溶液中加eb （最终浓度为0.5（ig/ml）,摇匀，待凝胶溶液冷却至50°c左右 时，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。待凝胶完全冷却后，在电泳槽 内加入约1000ml 0.5xtbe电泳缓冲液。小心地在凝胶上打孔取梳，以保 持点样孔的完好。取81 rt-pcr反应产物，加入2gl6x样品缓冲液混合 后，小心点样。开启电源，电压5v/cm,时间2.5h。以puc mix marker 为分子量标准在电泳中途用紫外灯直接观察，电泳

41、完毕后在紫外灯下用紫 外凝胶成像分析系统扫描灰度。表2 1.7%琼脂糖凝胶缓冲液配方tabic 2.dispensation of1.7% agarose gel bufferloxtbe电泳缓冲液（ph 8.0）6x样品缓冲液1.08% tris0.25% 溴酚蓝5.5%硼酸40%蔗糖水溶液0.02 mmol/l edt八naoh双蒸水双蒸水4 统计学处理计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行单因素方差分析，均 由spss 11.0软件统计包完成。检验水准：（x=0.05。c-myc odn作用mcf-7细胞后总rna提取样品的质量：紫外分光光度计测定对照组、sodn

42、组及asdon组总rna,浓度为 0.73.0|ig/pl，纯度 awa280 为 1.72.1 (1 ommol/l tris-hcl, ph7.5 ) o 溴化乙锭染色后，在紫外灯下观察，可见28s和18s两条清晰带，前者 的质量是后者的2倍。(见图1)s m阁11.2%变性甲醛琼脂糖凝胶电泳检测总rna提取质呈table l integrity of the total rna detected by 1.2% formaldehyde agarosegel electrophoresis(m: rna marker 18s&28s，s: total rna extraction

43、. 28s and 18s were seenclearly, and the mass of the former was two bigger than the latter，whichshowed the total rna was complete)二、转染前后mcf-7细胞中htertmrna相对的表达量三组样品总rna进行mmlv 一步法rt-pcr反应扩增后，凝胶电泳紫外灯下直接观察，各组均在puc mix marker 145bp处可见明暗不一的htert扩增产物，于540bp处可见明喑一致的内对照p-actin扩增产物， 表明各组的htert mrna表达量不同。（见图2）紫

44、外凝胶成像灰度定 量，单因素方差分析显示：asodn作用于mcf-7细胞24、48、72h时htert mrna相对表达量分别与对照组、lr-sodn组相比，有显著性差异 （p<0.01）;而 sodn 作用于 mcf-7 细胞 24、48、72h htert mrna 相 对表达量分别与对照组相比，无显著性差异（p0.05）。并且lr-asodn 组htert mrna相对表达量随时间的递增而明显降低（见圈3）。m 1234567 m图2 rt-pcr检测反义c-myc对mcf-7细胞htert 基因表达的影响fig 2. effect of antisense c-myc on ht

45、ert mrna levels inmcf-7 cells by rt-pcr.(the expected size of the product of htert mrna is 145bp; the internal control is 540bp fromp-actin cdna. lane 1:lr-asodn 72h group; lane 2:lr-asodn 48h group; lane 3:lr-asodn 24hgroup; lane 4:lr-sodn 72h group; lane 5:lr-sodn 48h group; lane 6:lr-sodn 24h gro

46、up; lane7:control group; m: puc mix marker)表3.各组的htert mrna相对表达量table 3 the relative expression of htert mrna in every group lr-sodnlr-asodncontrol24h48h72h24h48h72ha0.7050.7040.7030.6990.5890.2890.148b0.7130.7140.7130.7160.6120.2180.136c0.7530.7500.7470.7420.5380.2740.131d0.7240.7240.7260.7190.6140

47、.2650.159e0.7330.7310.7300.7300.7010.2540.143表4 c-myc正反义寡核苷酸对mcf-7细胞htert基因表达的作用 tabic 4. sense and antisense oligodcoxynuclcotidc of htert affect htert gene ofmcf-7 cells （x士s，n=3）grouplevels of htert mrnacontrol0.726土 0.019lr-sodn24h0.725士 0.01748h0.724土 0.01672h0.721 土 0.015lr-asodn24h0.6kh0.021*

48、48h0.240士0.069*72h0.143 士 0.0 ipthe mean difference is significant at the .05 level.*p<0.01 vs control, lr-sodn. control: mcf-7 cells; lr-sodn: mcf-7 cells +sense c-myc oligonucleotide for24h，48h，72h respectively; lr-asodn: mcf-7 cells +antisense c-myc oligonucleotide for 24h，48h，72h respectively

49、.娜旦13不同处理趣itert mrnag表5达1fig 3. levels of htert mrna in every group at different time(effect of antisense c-myc on mcf-7 cells htert mrna increased with the time following, x: different treated groups; y: levels of htert mrna. group 1:mcf-7 cells; group2,3,4: mcf-7 cells+ sense c-myc for 24h，48h，72h

50、respectively; group5,6,7: mcf-7 cells+ antisense c-myc for 24h，48h，72hrespectively.)1. rt-pcr检测htert基因表达的定量分析及意义htert是端粒酶活性的催化亚单位，因而htert基因的研究成为端粒酶相关研宄的焦点，而rt-pcr是研究这一基因表达的常用技术，然而 在继往的众多研宂屮，大多对结果采取定性分析。本实验以rt-pcr技术 对c-myc asodn作用后的htert基因进行定量。实验选择p-肌动蛋白(p -actin)的表达作为内对照。p-肌动蛋白是一种细胞骨架蛋白，进化上高度保 守，细胞中

51、的表达水平恒定，常用来做pcr反应的内对照，以检测pcr反 应的效果。本研究以htert/p-actin的比值，表示htert基因表达的相 对含量。这种和对定量能避免各种影响因素，比绝对定量更具优越性。此 外，p-actin作为pcr操作过程巾的实验内对照，可以验证pcr反应本身 冇无污染、rna降解及纯度等情况，确保实验结果的可信度。rt-pcr是以rna为模板进行的pcr反应。在研究中，避免rna酶 对模板降解是实验成败的关键。本研允中所有操作均在清洁无尘的环境中 进行，避免身体直接与反应液接触，操作有关的仪器用depc处理过的水 冲洗，奋关试剂用depc处理过的水配制。结果显示：rna提

52、取物浓度为 0.73.0 pg/gl;纯度 a260/a28。为 1.72.1 (10mmol/ltris-hcl，ph7.5),进 行1.2%变性甲醛琼脂糖凝胶电泳分析，28s和18srna两条带清晰可见， 前者光亮度是后者的2倍，说明rna模板完整、提取效果理想。实验还对经典rt-pcr技术加以改进：(1)简化操作：木研究采用的是 mmlv 一步法rt-pcr，其rt/taq mix混合酶包括m-mulv逆转录酶和taq dna聚合酶，既适合于cdna合成又可以进行pcr扩增，将原本两步进 行的反应并作一步，只需调整试剂间的浓度比例及扩增反应的时间，与常 规rt-pcr技术和比，操作更加简

53、单，而且不影响反应结果。(2)提高准确 度：实验屮使用的反转泶酶来源于mmlv，这种酶更适合于rt-pcr,因为它的rnase h活性相对较弱，而高活性rnase h易催化dna-rna杂合 链屮rna部分的内降解作用，导致抑制edna的产生及限制其合成长度， 影响反应的准确性；并且mmlv来源的反转录酶更适合于合成0.5-1.0kb 的扩增条带，本实验的目的条带正在此范围内。特异性更强：pcr反 应的特异性取决于引物的序列设计、酶的质量和模板的制备等。本研究在 选择了高质量的mmlv反转录酶和保证rna模板的质量外，在引物设计 方面，针对htert基因5'端启动子序列设计了高度特异性

54、的上下游引物，以p-actin为内对照，凝胶电泳分析各组均见清晰的145bp目的带和540bp p-actin带，无非特异性扩增条带出现，具有很高的特异性。很多研究证明htert与端粒酶表达呈平行关系。wisman等在人卵巢 癌中利用rt-pcr方法检测了 htert的mrna表达，同时用trap法检 测端粒酶活性，结果证实二者在恶性肿瘤中表达模式相同因而认为， 应用rt-pcr检测htert可反映端粒酶活性i5】，而且这种针对htert的 rt-pcr法较针对端粒酶的trap法，方法更简便，并降低检测费用。近 年一些研宄应用rt-pcr技术半定量检测htert mrna的表达来评价端 粒酶活

55、性mimiq。本研究采用定量方法检测mcf-7细胞中htert mrna表达量获得了满意的结果，定量rt-pcr更能精确评价基因的表达状况，不仅可以反映基因表达与否，还可反映基因的表达水平。因此，作者认为 定量rt-pcr是htert基因表达分析中一种更可靠的技术，它可用于评价 针对端粒酶抑制的基因治疗效果等相关研究中。2. c-myc反义寡核苷酸对mcf-7细胞htert基因表达的调控作用 端粒酶由rna成分(htr)、端粒酶相关蛋0 (tp1)和催化亚单位(htert)组成，其中htert是端粒酶的限速成分，htert基因表达的 上调是端粒酶激活的主要途径。而htert的表达乂在多层面上受

56、到多因 子的调控。c-myc是由myc原癌基因编码的一种转录因子，参与细胞的分化与增殖，其调控表达异常与肿瘤发生密切相关。新近很多研宂表明，c-myc是 参与htert调控的重要因子，它能通过激活htert的表达而导致肿瘤发 生。林勇等利用瞬时转染实验，采用在脂质体lipfectamineim （lr）介导下，将含有c-mycdna质粒分别转染入肝癌细胞hepg2、猴肾c0s-7 细胞和nih3t3细胞，结果发现c-myc可以直接激活htert启动子的表达, xl c-myc的激活作用与其剂量呈正相关。sangtaek等21应用c-myc反义核 酸作用hela细胞，发现c-myc和htert基

57、因表达均下降且两者呈平行关 系。随着htert基因结构的克隆成功，发现htert基因5'侧翼存在18 个规范的c-myc结合位点cacgtg （e盒），其数目比其它c-myc靶基因 中e盒数目更多；第二内含子中一段区域包含9个e盒。kyo等进一步 研究发现，htert基因结构中邻近atg位点的两个e盒对于其转录活性 上调更冇意义；e盒突变后，c-myc的激活作用明显下降。还有研究发现，外源性myc与e盒结合后，对htert基因表达具有直接激活作用，其激 活作用与细胞堉殖无关，也不依赖于其它新合成蛋白质的辅助作用队24。本研宄前期研宄屮，利用反义核酸技术将c-myc asodn转染到mc

58、f- 7细胞中，结果c-myc蛋白表达下降，htert蛋白表达也下降25，冋吋细 胞生长受到抑制岡并出现凋亡现象。表明c-myc反义核酸可能通过影响 htert蛋白表达，抑制细胞生长。本研究用相对定量rt-pcr检测反义c-myc作用mcf-7细胞后htert mrna表达水平，进一步观察反义c-myc对mcf-7细胞中htert基因的 作用效应及影响程度。结果发现：c-myc sodn作用于mcf-7细胞24h、48h、 72h后，htert基因表达无明显变化，mrna相对表达量与对照组相比无 明显差异（p0.05），而c-myc asodn作用于mcf-7细胞24h后，htert mrna相对表达量即出现明显下降（0.610士0.021,而对照组为0.726土0.019），作用241k 4