ZIC基因过表达可通过下调Survivin基因抑制乳腺癌的生长

1、江苏大学硕士学位论文分类号 R737-9 密级 UDC 编号 JIANGSU UNIVERSITY硕士学位论文MASTERS DISSERTATION论文题目： ZIC1基因过表达可通过下调Survivin基因抑制乳腺癌的生长 学科专业： 外科学 作者姓名： 韩 玮 指导教师： 丁厚中 答辩日期： 2018.04. 1独 创 性 声 明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个

2、人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 年 月9学位论文版权授予书本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保 密 ，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密 。学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：2018年 月 日 签字日期：2018年 月 日摘要背景与目的ZIC1基因和Survivin基因分别被认为是一个潜在的抑癌基因和促癌

3、基因，并在乳腺恶性肿瘤的发生、发展中起到了重要的作用。本研究旨在进一步确认ZIC1基因在乳腺癌中的作用，分析ZIC1基因与Survivin基因在乳腺癌中的表达水平相关性，并探索与ZIC1基因相关的分子机制。方法（1） 收集120例在2014年-2015年间于上海长海医院行乳腺癌根治术的浸润性乳腺癌患者，应用免疫组织化学技术检测乳腺癌组织及对应的癌旁组织中ZIC1蛋白和Survivin蛋白的表达水平，并分析癌组织中两种表达的相关性；（2） 选取六种人乳腺癌细胞株（MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-453，SK-BR3，BT-474和BT-549），和一种人正常乳腺上皮细胞株MCF-

4、10A，常规培养后，提取总蛋白，进行western blotting技术检测ZIC1蛋白与Survivin蛋白的表达情况，并筛选合适的乳腺癌细胞株用于后续实验；（3） 应用rLV-ZsGreen-PGK-Puro和rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒进行细胞转染，嘌呤霉素筛选细胞后，稳定培养，并应用荧光显微镜及western blotting技术检测ZIC1蛋白转染效率及Survivin蛋白的表达情况；（4） 应用MTT法检测稳定转染rLV-ZsGreen-PGK-Puro或rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞增殖能力；（5） 应用

5、平板克隆试验检测转染rLV-ZsGreen-PGK-Puro或rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞克隆形成能力；（6） 应用流式细胞术检测转染rLV-ZsGreen-PGK-Puro或rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞细胞周期分布情况；（7） 应用流式细胞术检测转染rLV-ZsGreen-PGK-Puro或rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞细胞凋亡情况；（8） 利用MinuteMitochondria Isolation Kit提

6、取转染rLV-ZsGreen-PGK-Puro或rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞内线粒体及胞浆蛋白；（9） 利用JC-1试剂盒检测转染rLV-ZsGreen-PGK-Puro或rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞的纯化的线粒体膜电位水平；（10） 应用western blotting技术检测转染rLV-ZsGreen-PGK-Puro或rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒的MDA-MB-231和SK-BR3乳腺癌细胞内Akt以及线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况；（11） 收集

7、稳定转染rLV-ZsGreen-PGK-Puro或rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒载体的MDA-MB-231细胞，于裸鼠右侧背部皮下种植成瘤，观察并记录种植肿块的生长变化，于39日后，处死，取组织，包埋，制成组织切片，应用免疫组织化学技术检测ZIC1蛋白及Survivin蛋白的表达情况。结果（1）ZIC1蛋白仅表达在细胞质内，然而Survivin蛋白在胞核内及胞质内均有表达；ZIC1在浸润性乳腺癌组织中的表达明显低于其对应的癌旁正常乳腺组织；而Survivin蛋白在癌组织中的表达明显高于癌旁正常乳腺组织；癌组织中ZIC1蛋白的表达明显低于Survivin，并且两者蛋白表达分数之间存在着

8、明显负相关。（2）乳腺癌细胞株内ZIC1蛋白表达水平均低于乳腺正常上皮细胞，并与Survivin蛋白表达情况相对，稳定转染rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒后的MDA-MB-231和SK-BR3细胞内，Survivin蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。（3）ZIC1蛋白过表达后，乳腺癌细胞生长被阻滞于G1期，细胞增殖活力、克隆形成能力以及线粒体膜电位水平明显下降，Cyto-C蛋白从线粒体中被释放到胞浆，并且细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。（4）“ZIC1”组种植瘤瘤体体积明显小于“Vector”组，且“ZIC1”组种植瘤瘤体生长速度明显低于“Vector”组；相对

9、于“Vector”组，“ZIC1”组乳腺癌种植瘤瘤体组织中ZIC1蛋白表达水平明显增高，Survivin蛋白表达水平也明显降低。（5）乳腺癌细胞ZIC1蛋白过表达后，Akt，mTOR，P70S6K蛋白的磷酸化水平明显下调，CyclinD1表达水平明显下降，P21及P27水平明显升高，另外，Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达明显降低，Bad磷酸化水平也明显下降，并且Bad蛋白表达水平明显上调，Caspase-9和Caspase-3也受到明显激活作用。结论（1）ZIC1在浸润性乳腺癌组织中的表达明显低于其对应的癌旁正常乳腺组织，而Survivin蛋白与之相反，并且两者之间存在着明显负相关。（2）稳定

10、转染rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒后的MDA-MB-231和SK-BR3细胞内，Survivin蛋白表达水平明显降低。（3）ZIC1蛋白过表达后，可以通过阻滞乳腺癌细胞生长于G1期来抑制细胞增殖活力及克隆形成的能力。（4）ZIC1蛋白过表达后，乳腺癌细胞内线粒体膜电位水平明显下降，Cyto-C蛋白从线粒体中被释放到胞浆，进而促进乳腺癌细胞发生细胞凋亡。（5）“ZIC1”组种植瘤瘤体生长速度明显低于“Vector”组，且ZIC1蛋白过表达后，能够在瘤体内持续抑制Survivin蛋白的表达。（6）乳腺癌细胞ZIC1蛋白过表达后，Akt/mTOR信号通路的活性受到明显的抑制作用，致使乳

11、腺癌细胞增殖能力明显受到抑制；ZIC1蛋白过表达后，可以调控乳腺癌细胞内CyclinD1、P21以及P27的表达水平，进而阻滞乳腺癌细胞于G1期内；ZIC1表达升高可以通过线粒体凋亡途径，调控线粒体相关的蛋白表达，降低乳腺癌细胞的线粒体膜电位，并促进乳腺癌细胞发生细胞凋亡的作用。关键词：ZIC家族；Survivin；乳腺恶性肿瘤；分子机制ABSTRACTObjective: ZIC1 gene and Survivin gene are considered to be a potential tumor suppressor gene and an oncogene, respectivel

12、y, and play important roles in the occurrence and development of breast malignancies. This study aims to confirm the role of ZIC1 gene in breast cancer, analyze the correlation between ZIC1 gene and Survivin gene expression in breast cancer, and explore the molecular mechanism of ZIC1 gene in breast

13、 carcinoma. Methods: (1) 120 cases in Shanghai changhai hospital were collected to detect the levels of ZIC1 and Survivin expression of breast cancer and corresponding adjacent tissues, and analyzed the relationship of ZIC1 and Survivin expression by IHC.(2) Select six human breast cancer cell lines

14、, and a normal mammary epithelial cell line, with regular culturing, and then used western blotting technique to detect the expression of ZIC1 and Survivin;(3) Transfected rLV-ZsGreen-PGK-Puro or rLV-Zic1-PGK-Puro into MDA-MB-231 and SK-BR3 breast cancer cell lines, and then used the fluorescence mi

15、croscope and western blotting technology to assess the transfection efficiency, and analyze the relationship between ZIC1 and Survivin protein;(4) MTT method was uesd to detect the proliferation ability of MDA-MB-231 and SK-BR3 breast cancer cell after ransfecting rLV-ZsGreen-PGK-Puro or rLV-Zic1-PG

16、K-Puro;(5) The tablet cloning test was used to detect the lone formation efficiency of MDA-MB-231 and SK-BR3 breast cancer cells after ransfecting rLV-ZsGreen-PGK-Puro or rLV-Zic1-PGK-Puro;(6) Flow cytometry was used to detect the cell cycle distribution of MDA-MB-231 and SK-BR3 breast cancer cells

17、after ransfecting rLV-ZsGreen-PGK-Puro or rLV-Zic1-PGK-Puro;(7) Flow cytometry was used to detect the apoptosis of MDA-MB-231 and SK-BR3 breast cancer cells after ransfecting rLV-ZsGreen-PGK-Puro or rLV-Zic1-PGK-Puro;(8) MinuteMitochondria Isolation Kit was used to extract mitochondria and cytoplasm

18、 protein in breast cancer cells;(9) The JC - 1 kit was used to detect the purified mitochondrial membrane potential of MDA-MB-231 and SK-BR3 breast cancer cells;(10) Western blotting technique was used to detect the expression of related proteins in the MDA-MB-231 and SK-BR3 breast cancer cells;(11)

19、 Collect and injected stable transfected cells into the right side of the back subcutaneous in nude mice. Observe and record the growth of the mass change. At 39 days, obtained the tissues and used immunohistochemistry technique to detect the expression of Zic1 and Survivin.Results: (1) ZIC1 was exp

20、ressed only in the cytoplasm, whereas Survivin was expressed both in the nucleus and cytoplasm. ZIC1 expression in tumors was significantly lower than that of normal tissues, opposite to Survivin. ZIC1 expression in tumors was significantly lower than that of Survivin, with a significant negative co

21、rrelation.(2) ZIC1 expression in breast cancer cell lines was lower than that of normal breast epithelial cell, opposite to Survivin. After transfecting, Survivin expression was also significantly decreased (P < 0.05).(3) The growth of breast cancer cell with high expression of ZIC1 was blocked i

22、n G1 phase, and its cell proliferation activity, clone formation ability and level of mitochondrial membrane potential was decreased obviously, along with Cyto-C protein to be released from the mitochondria into the cytoplasm, and the apoptosis rate was increased significantly (P < 0.05).(4) Tiss

23、ues of "ZIC1" group were significantly smaller than the "Vector" group. The expression level of ZIC1 was significantly higher in “ZIC1” group, and Survivin was significantly lower than that in “Vector” group.(5) With high expression of ZIC1, the levels of phosphorylation of Akt,

24、mTOR and P70S6K were significantly decreased, CyclinD1 expression was also decreased obviously and P21 and P27 was increased. In addition, Bcl-2 and Bcl-xL was decreased obviously, the level of phosphorylation of Bad was decreased, Bad expression was raised obviously, and Caspase9 and Caspase3 was a

25、ctivated. Conclusions: (1) ZIC1 expression in invasive breast cancer was significantly lower than that of normal breast tissues, opposite to Survivin, and there was a significantly negative correlation between ZIC1 and Survivin.(2) The level of Survivin was significantly reduced due to high ZIC1 exp

26、ression.(3) With high ZIC1 expression, proliferation and clone formation efficiency was inhibited by blocking the growth of breast cancer cells in the G1 phase.(4) With high ZIC1 expression, mitochondrial membrane potential was significantly decreased and Cyto-C was released from the mitochondria in

27、to the cytoplasm, and then apoptosis was promoted.(5) The tumor growth rate in "ZIC1" group was significantly lower than "Vector" group, and Survivin could be suppressed continuously with high ZIC1 expression.(6) The activation of the Akt/mTOR signaling pathway was significantly

28、inhibited with high ZIC1 expression in breast cancer cells, while the mitochondrial apoptotic pathway was promoted.Keywords: ZIC family; Survivin; breast cancer; molecular mechanism目 录第一章 绪论.11.1 引言.11.2 研究目的及意义.21.3 实验技术.31.4 实验方案设计.3第二章 材料与方法.42.1 实验材料.42.1.1 组织与细胞株.42.1.2 主要试剂.42.1.3 主要仪器.52.2 实验

29、方法.62.2.1 细胞培养.62.2.1.1 细胞复苏.62.2.1.2 细胞传代培养.72.2.1.3 细胞冻存.82.2.2 细胞筛选.92.2.3 细胞转染.102.2.4 MTT法检测ZIC1过表达对乳腺癌细胞增殖能力的影响.102.2.5 平板克隆实验检测ZIC1过表达对乳腺癌细胞克隆形成能力的影响.102.2.6 流式细胞术检测ZIC1过表达对乳腺癌细胞周期分布情况的影响.112.2.7 流式细胞术检测ZIC1过表达对乳腺癌细胞凋亡情况的影响.112.2.8 Western blot试验.112.2.9 线粒体膜电位检测.122.2.10 裸鼠荷瘤实验.132.2.11 免疫组化

30、.132.2.12 统计学处理.14第三章 实验结果.153.1 ZIC1及Survivin在乳腺癌中的表达.153.1.1 ZIC1及Survivin在乳腺癌组织中的表达.153.1.2 ZIC1及Survivin在乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞株中的表达.163.2 ZIC1过表达后对乳腺癌细胞生物学行为的影响.163.2.1 稳转细胞株构建情况及转染效率评估.163.2.2 ZIC1过表达后对乳腺癌细胞增殖能力的影响.173.2.3 ZIC1过表达后对乳腺癌细胞线粒体膜电位水平及凋亡情况的影响.183.3 裸鼠荷瘤实验结果.203.3.1 裸鼠瘤体生长状况.203.3.2 瘤体组织内ZIC1及

31、Survivin蛋白表达情况.203.4 Western blotting技术分析过表达ZIC1蛋白对乳腺癌细胞内信号通路的影响.21第四章 实验讨论.23参考文献.25综述.28硕士在读期间发表论文.40致谢.41 注释表 英文缩写英文全称中文名称ZIC1Zinc finger of the cerebellum 1小脑锌指结构1GliGlioma-associated oncogene homolog神经胶质瘤致病基因PI3KPhosphatidylinositol 3-kinase磷脂酰肌醇3-激酶MAPKMitogen-activated protein kinase丝裂原活化蛋白激酶

32、AktProtein Kinase B丝氨酸/苏氨酸激酶mTORMammalian target of rapamycin一种蛋白质MTT3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide噻唑蓝DMEMDulbecco's modified eagle medium 改良杜氏伊格尔培养基FBSFatal bovine serun胎牛血清PBSPhosphate buffer saline磷酸缓冲盐溶液DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜RIPARadio-Immunoprecipitati

33、on Assayripa裂解液GAPDHGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase甘油醛-3-磷酸脱氢酶GFPGreen fluorescent protein绿色荧光蛋白PVDFPolyvinylidene fluoride聚偏二氟乙烯膜TBSTTBS TweenTris-HCl缓冲盐溶液ECLElectro-Chemi-Luminescence电化学第一章 绪论1.1 引言乳腺恶性肿瘤，是女性最常见恶性肿瘤之一，仅仅2017年中国就超过十万例乳腺癌新发病例，同时预计40610女性死于乳腺癌，其高发生率、高复发率及高死亡率严重影响着全球女性的生

34、命健康，已然成为我国重大的社会及经济负担，改善诊治及预防仍有很长的路要走1,2。 目前，对于乳腺癌明确的发病机制，现有的相关研究存在区域分布不同，传统的危险相关因素如初潮早、未产妇、初次足月产年龄推迟、母乳喂养时间短以及家族遗传史与中国地区乳腺恶性肿瘤的发病率增高存在明显关联3-6。但对于女性生育的次数这个因素存在不同结果报告，有文献表明，每位女性生育次数的增加与绝经后乳腺癌发病风险降低相关7。然而，一项实验研究中未观察到该因素与乳腺恶性肿瘤相关发病风险的关联性，这可能与中国的计划生育政策有关4。同时，流行病学研究发现妇女绝经后肥胖，与乳腺恶性肿瘤高风险密切相关8-10。不仅如此，糖尿病患者被

35、证实有10%-20%的额外发病风险11，然而在中国未受到足够的重视，仅有Wang等12的研究证实在中国人群中有同样类似的关系。随着人们对乳腺癌的认识的进步，从缺乏科学的指导、把乳腺癌当做局部疾病到认识到乳腺癌是一种全身性疾病，全世界对乳腺癌的治疗方式发生巨大改变，由局部手术治疗到根治性手术+综合性辅助治疗的模式13。然而，全球乳腺癌发生率仍然不断上升，同时死亡率居高不下，主要原因依旧是乳腺癌发生和发展的关键分子和信号通路仍不明了，无法干预其发生发展、丰富乳腺癌治疗手段，最终提高患者生存期。ZIC1基因（zinc finger of the cerebellum 1），属于ZIC家族的成员之一，

36、位于染色体3q25.1。ZIC1基因通过编码一种锌指蛋白ZIC1来参与调节人体正常生长发育及生理代谢过程14-15。目前，大量文献报道，在多种恶性肿瘤中，包括消化道系统肿瘤和甲状腺肿瘤，ZIC1的激活能够通过下调Akt和Erk的磷酸化水平来抑制癌细胞的生长，起到抑癌作用16-18。另外，ZIC1基因在多种肿瘤组织中的甲基化水平明显高于癌旁正常组织，并且其表达蛋白水平能够成为肿瘤患者预后潜在的生物学指标16-20。经过沉默乳腺癌细胞株BT-549细胞中PIGX、RCN1和RCN2后，BT-549细胞的生长受到明显抑制，同时ZIC1表达水平受到明显增高21。然而，关于ZIC1基因在乳腺癌中的作用及

37、机制需要进一步探讨和分析。Survivin，又被称为BIRC5（baculoviral IAP repeat containing 5），位于染色体17q25.3，是一个新型的凋亡抑制基因，能够调控细胞有丝分裂，并能增强对抗癌化疗药物的耐药性22,23。另外，Survivin在多种恶性肿瘤中常为高表达状态，而在正常组织中表达极低，这些发现表明Survivin的过表达与致癌作用密切相关22-25。不仅如此，最近的研究结果表明，Survivin能够通过抑制Caspase-9和Caspase-3的活性来抑制癌细胞的凋亡，并且其表达常为Akt和mTOR的异常过度磷酸化而上调26,27。在我们的前期对Z

38、IC1在乳腺癌的研究基础中，我们发现，ZIC1蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率明显低于对应癌旁组织，并且ZIC1蛋白表达水平与乳腺癌组织学分级以及淋巴结转移情况呈负相关；转染ZIC1基因后，乳腺癌细胞的增殖能力、侵袭能力受到明显的抑制作用，并且与姜黄素在抑癌作用方面可能存在协同作用28,29。这些研究结果表明，ZIC1 基因在乳腺恶性肿瘤的发生、发展中起到了重要的作用。因此，本研究旨在进一步确认ZIC1基因在乳腺癌中的作用，分析ZIC1基因与Survivin基因在乳腺癌中的表达水平相关性，并探索与ZIC1基因相关的分子机制。1.2 研究目的及意义 目前，ZIC1基因是新型的被认为是起到抑癌作用的

39、基因，能够抑制多种恶性肿瘤的生长，而在乳腺癌中的研究较少。Survivin基因则是一个新型的凋亡抑制基因，起到促癌的作用。故本研究首先通过免疫组化的方法检测乳腺癌组织及其癌旁组织以及七种乳腺细胞株中ZIC1和Survivin的表达水平，并研究两者表达水平的相关性；再通过慢病毒转染技术，构建稳定的ZIC1过表达乳腺癌细胞株，并通过western blot技术鉴定ZIC1蛋白表达情况；同时，通过MTT实验和细胞克隆形成实验检测乳腺癌细胞增殖能力的变化；并利用流式细胞术测定各实验组MDA-MB-231细胞的细胞周期分布及细胞凋亡情况；再通过JC-1试剂盒检测稳转细胞株线粒体膜电位水平；通过将稳定转染

40、的细胞种植于裸鼠皮下，观察瘤体形成及生长情况；最后，再次利用western blotting技术检测Akt以及线粒体凋亡信号通路相关关键蛋白。通过我们的研究，有可能证实ZIC1在乳癌中的表达异常及与Survivin蛋白表达的相关性；过表达ZIC1基因可能抑制乳腺癌细胞增殖能力，阻滞细胞周期，降低线粒体膜电位水平，以及增强癌细胞凋亡率，并且裸鼠瘤体生长受到明显抑制；另外，ZIC1蛋白过表达后能够抑制Akt蛋白的磷酸化水平，进而抑制Survivin蛋白的表达。本研究为我们将来进一步探讨ZIC1在肿瘤形成中的机制提供理论依据。1.3 实验技术 本文拟采用免疫组化、western blotting、细

41、胞转染、MTT法、细胞克隆形成实验、流式细胞术、线粒体膜电位检测以及裸鼠荷瘤实验等方法研究ZIC1基因在乳腺癌中的作用机制。1.4 实验方案设计第二章 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 组织与细胞株收集120例在2014年-2015年间于上海长海医院行乳腺癌根治术的浸润性乳腺癌患者，中位年龄为52.19±12.38岁，所有患者在术前均未接受过任何放疗及化疗治疗，每例均包含乳腺癌组织及对应的癌旁组织。选取六种人乳腺癌细胞株（MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-453，SK-BR3，BT-474和BT-549），和一种人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A，均购自复旦IBS细

42、胞库。所有乳腺癌细胞株均培养于含10%胎牛血清的培养基中，于37、5%CO2培养箱中常规培养：MCF-7和SK-BR3细胞株培养于高糖DMEM培养基中；MDA-MB-231，BT-549和BT-474细胞株培养于RPMI-1640培养基中；MDA-MB-453细胞株培养于Leibovitz's L-15培养基中。乳腺上皮细胞株培养于复旦IBS细胞库特定培养基DF-12+5%HS+EGF (20 ng/ml) +hydrocortisone (0.5g/ml)+choleratoxin (100g/ml)+insulin (10g/ml)。2.1.2 主要试剂试剂公司SP Rabbit

43、& Mouse HRP Kit北京康为世纪生物技术有限公司中性树胶上海研拓生物科技有限公司胎牛血清美国Gibco公司DMEM美国Gibco公司RPMI-1640美国Gibco公司Leibovitz's L-15美国Gibco公司无血清培养基美国Gibco公司PBS美国Gibco公司胰蛋白酶美国Gibco公司双抗（链霉素，青霉素）美国Gibco公司裂解液碧云天生物技术研究所化学发光检测试剂盒美国Pierce公司MTT试剂盒碧云天生物技术研究所BCA蛋白测定试剂盒碧云天生物技术研究所PMSF碧云天生物技术研究所磷酸化酶抑制剂北京康为世纪生物技术有限公司上样缓冲液北京康为世纪生物技术

44、有限公司SDS-PAGE快速配制试剂盒碧云天生物技术研究所APC/7-AAD凋亡试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司rLV-ZsGreen-PGK-Puro慢病毒颗粒武汉巴菲儿生物技术有限公司rLV-Zic1-PGK-Puro慢病毒颗粒武汉巴菲儿生物技术有限公司雌性裸鼠六只武汉巴菲儿生物技术有限公司Minute Mitochondria Isolation Kit美国Invent Biotechnologies公司细胞周期检测试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司polybrene美国Sigma-Aldrich公司puromycin中国TargetMol公司兔抗ZIC1多克隆抗体北京博奥森生物技术有

45、限公司小鼠抗Survivin单克隆抗体苏州睿赢生物技术有限公司小鼠抗Akt单克隆抗体苏州睿赢生物技术有限公司小鼠抗p-Akt单克隆抗体苏州睿赢生物技术有限公司兔抗mTOR多克隆抗体苏州睿赢生物技术有限公司兔抗p-mTOR多克隆抗体苏州睿赢生物技术有限公司兔抗CyclinD1多克隆抗体北京博奥森生物技术有限公司兔抗P21多克隆抗体美国ImmunoWay Biotechnology公司兔抗P27多克隆抗体美国ImmunoWay Biotechnology公司兔抗P70S6K单克隆抗体美国Cell Signaling Technology公司兔抗p-P70S6K单克隆抗体美国Cell Signali

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49、位。（3）从37水浴箱中取出含有乳腺癌细胞或乳腺上皮细胞的冻存管，置于紫外线照射过的超净台内，接着打开盖子，用吸管缓慢地吸出细胞悬液，加到滴加10倍以上体积培养液的离心管内，混匀；（4）打开离心机，设置转速为1000转/每分钟，离心时间设置为5min；（5）置于紫外线照射过的超净台内，弃去离心管内上清液，加入含有10%浓度的胎牛血清的培养液或乳腺上皮细胞特定培养基，重悬细胞，计数，用含有10%浓度的胎牛血清的培养液或乳腺上皮细胞特定培养基调整细胞密度，接种于新的培养瓶，于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱内静置培养；（6）第二日更换一次培养液（含有10%浓度的胎牛血清的培养液或乳腺上皮细胞特定培养

50、基），继续培养。2.2.1.2 细胞传代培养 （1）进入无菌室之前，用肥皂洗手，碘伏消毒，用75%的酒精擦拭并消毒双手数次，穿好消毒处理好的白大褂，戴好口罩与帽子，进入无菌细胞培养室，进行细胞实验前，紫外线照射超净台30分钟。 （2）利用倒置显微镜下仔细观察乳腺癌细胞或乳腺上皮细胞的形态，确定细胞是否需要进一步传代，将培养液放置于37摄氏度水浴箱内进行预热。 （3）保证超净台台面应整洁，用含75%浓度的酒精棉球擦洗干净，打开超净台的紫外灯照射台面时间约30分钟，进行细胞传代前关闭超净台内的紫外照射灯，打开抽风机抽风清洁超净台内的空气，并除去臭氧。 （4）用打火机点燃超净台内的酒精灯，调节酒精灯

51、火焰的大小，不宜过猛;用手拿出无菌的试管，巴斯德吸管以及带刻度的吸管，并用75%浓度的酒精消毒，置于超净台内;缓慢地过酒精灯的火焰稍微烧一下后插入无菌的试管之内。 （5）将含有10%浓度的胎牛血清的培养液或乳腺上皮细胞特定培养基的瓶口，PBS的瓶口及0.25%胰蛋白酶的瓶口，用75%浓度的酒精进行消毒，酒精棉球擦干后，缓慢地过酒精灯的火焰之后，倾斜地放置于超净台内酒精灯旁边的试管架子上。 （6）将旧的细胞培养瓶缓慢地过酒精灯的火焰之后，打开瓶盖，再次稳定地过酒精灯的火焰，倒掉含培养细胞的培养瓶内的旧的培养基，并每次加入约1 - 2 mL的PBS液体，旧培养瓶瓶口过酒精灯火焰后，倒掉培养瓶内加入的PBS液体，重复操作三次。 （7）之后，在每个旧培养瓶内加入1mL胰蛋白酶，旧培养瓶瓶口过酒精灯火焰后，盖好瓶盖，并在倒置显