水质生物监测方法

1、水质生物监测方法2012级6班 李斐学号：201210540616生物监测是水环境污染监测的方法之一，它是指利用生物个体、种群或群落对环境污染或变化所产生的反应阐明环境污染状况，具有敏感性、富集性、长期性和综合性等特点。目前在实际监测中已经应用的生物监测方法主要包括生物指数法、种类多样性指数法、微型生物群落监测方法(聚氨酯泡沫塑料块法，polyurethane foam unit，PFU)、生物毒性试验、生物残毒测定、生态毒理学方法等，涉及的水生生物涵盖单胞藻类、原生动物、底栖生物、鱼类和两栖类。除了鱼类，藻类和底栖生物这些在水污染生物监测上已经得到广泛应用的传统生物监测方法之外，生物监测的方

2、法在近几年得到了很大程度的发展。为了验证发光细菌法在测定水域水质毒性的用途，吴伟等利用明亮发光杆菌作为指示物，对受到污染的渔业水域的急性毒性进行了测定，试验表明在温度在 20到 30，pH 值界于 6 到 9 之间时，利用发光细菌法所测得的水域急性毒性的结果与鱼类毒性试验可以互相替代。华银峰等通过系统研究重金属和缓冲液类型及其浓度对脲酶抑制率的影响，为脲酶抑制法在快速检测重金属离子中最佳检测条件的选择提供了理论依据。陆贻通等也对酶抑制技术的条件进行了试验，研究表明当被测重金属是少数几种并能以抑制方式影响酶活性时，这种测定方式便能取得较好的结果。一、鱼类毒性实验鱼类是重要的水产资源,而且对水质污

3、染反应极其敏感。即使微小的环境变化,就可明显地影响鱼的生长发育及其生理活动,造成鱼类的变异或死亡。因而有人主张,水体污染的生物学研究应集中在鱼类和作为鱼类食料的生物中进行。因为水污染控制工作的重要目的之一,就是防止危害这类生物,保护自然资淤门。在进行水体污染调查时,往往由于污染源成分复杂,难以用单一的理化指标表示其污染程度,而通过鱼类试验则能够在一定程度上反映出水体的混合污染状况和污染物的毒性。鱼类试验不仅可以作为评价水体污染的综合指标,而且还可配合其他调查测定以制订工业废水的排放标淮。因此鱼类试验是一种简便、经济而又易于推广的方法,具有很大的实用价值目前已被某些国家列为标准方法。有一种鱼类的

4、生理学监测方法是根据污染物质引起鱼类的活动异常及呼吸与心跳等变化情况来判断水质状况的。将鱼直接置于河水中进行监测。例如在瑞典,曾将鱼类置于篓中,再将鱼篓悬于某些工厂废水排人的河流中,以监测水质污染的影响。或者在废水排人水体之前在工厂内进行废水对鱼类影响的监测在进行这类试验时,运用连续自动记录装置记录废水对鱼类活动方式变化及心跳和呼吸活动的影响。由于有效地利用这类厂内监测系统,而改进了水质污染的防治工作。在鱼类的毒理学试验方法方面,目前已积累了大量资料。一般是通过测定鱼类24、48和96小时的中间忍受限度值(TLm,即半数存活浓度)来评价污染物质的毒性。另外,当水体受到污染时,污染物质可以引起鱼

5、类的迥避反应。因而有人采用鱼类进行迥避试验,以测定污染物质的毒性。二、甲壳动物毒性实验如在海洋水质生物学监测中有人用叶足类甲壳动物鳃足虫(Arem:aSali,:a)。这种甲壳动物分布于世界各地,主要生存于各种海水与盐水湖中。它的卵可以干燥保存几年仍不失去活力,试验时可将保存的千燥虫卵在20条件下孵化24或48小时后即可孵化为可供试验用的幼虫(无节幼体期),因而容易得到大批同种、同龄的试验幼虫。近年来研究表明,在海洋污染监测工作中,以鳃足虫生物试验作为一个标准方法是有可能的。最近PI.ice等归曾对引起海洋污染的多种石油化学物质进行了周密的鳃足虫毒性试验。其毒性试验的基本方法如下:将虫卵孵化为

6、实验用幼虫。用5个1升容积的广口瓶做孵化器。将5个广口瓶排成一排,并以黑纸包裹起来,每瓶的两侧各留一小洞,以便透光。各瓶装有一个多孔玻璃扩散器作为曝气之用。每瓶加入一克虫卵,然后注满合成海水。合成海水的制备方法:称取氯化钠557.37克、硫酸钙27.20克、硫酸镁(MgSO;·7HZo)63.36克、氯化镁168.30克、氯化钾15.84克、澳化镁(MgBI.:·6HZO)3.14克。顺序将上述物质溶于20升蒸馏水中。在孵化过程中,孵化瓶内应不断曝气,直到孵化完成为止。将光源放到第一瓶侧的黑纸洞口处,使光线透过各孵化瓶。此时孵化出来的幼虫集中于孵化瓶的光束之内。然后用滴管将

7、幼虫移到各试验容器中。将一定体积的水通过一个特殊的网状滤器过滤,然后计数,即可得出每毫升水溶液中的鳃足虫数目。在正式测定各种污染物质对鳃足虫的中间忍受限度以前,同样亦应进行预试验,找出各种物质对鳃足虫的毒性范围,·314国外医学参考资料卫生学分册方法如下:1.将鳃足虫卵置上述孵化器中孵化48小时,以提供预试验的幼虫,2.将孵出的幼虫稀释成每毫升含3050个幼虫的混悬液;3.将各种试验的物质制成1%溶液,取出一定量的体积加到150毫升容积的各个广口瓶中,使其稀释到99毫升时其浓度分别为100、1,000和10,000毫克/升。不易溶解的物质则以海水制成饱和溶液进行试验,4.将1毫升幼虫

8、混悬液用吸管分别加到含有不同浓度试验物质的各个瓶中以及仅含有海水对照的瓶中,将瓶口盖上,但不要盖得过紧。然后置于24.5温度下再孵化24小时,5.孵化24小时后,籍助菌落计数器观察并记录试验瓶中死虫与活虫的数目。通过以上方法即可求出各种污染物质对鳃足虫的毒性作用范围。测定中间忍受限度时应采用的剂量浓度,可根据预试验结果来确定。三、细菌学检验当水源受到生活污水或工业废水污染时,水中的细菌也会发生一系列的改变。当然,废水的种类不同,对细菌的影响也不同。例如排人水体的阴离子表面活性剂在一定浓度条件下,可明显地促进水中腐物寄生菌、大肠杆菌和伤寒杆菌的繁殖20。因此,水的细菌学检查,也是判断水质的一项重

9、要指标。用于水质监测的细菌学检验有下述几种:1.细菌总数:细菌总数是1毫升水样在普通琼脂培养基上经过37c培养24小时后,所生长的各种细菌菌落总数。当水体受到人畜粪便等污染时,其细菌总数急剧增加。因此细菌总数可作为水体污染的指标之一。但此方法仅适于在人工培养基上在一定实验条件下繁殖的菌种,不是水中所有细菌都能在这种条件下生长。所以细菌总数不能表示水中的全部细菌。另外细菌也能随各种植物和矿物物质进人水体,与人畜的污染毫无关系。可见细菌总数既不能得出水中实际所含细菌的绝对数,也不能指明水中出现细菌的原因,同时更不能说明有无病原菌存在。因此,细菌总数在评价水体时只有相对的意义。一般认为,如水中细菌数

10、多,表示水中含有大量有机物的腐败产物,从而推测有病原菌污染的可能性,但不能肯定水体已受粪便污染。关于细菌计数,Bu(:ksteeg等采用下述两种方法2。(1)改良平皿计数法将样品接种在含有氯化2、3、5一三苯基四氮吐(2、3、5一triPhen,ltetrazoliumehloride一TTC)的琼脂平板或明胶平板上。培养后再将1%TTC水溶液喷雾到平板上。在活细菌细胞的还原酶作用下,无色的TTC还原成红色的甲腾(formazane)。结果平皿上的菌落变为红色,菌落计数更易于进行。(2)间接细菌计数法平皿计数法所得结果约占直接计数法所得出的细菌数的15%。为了更准确地检定细菌总数,根据活细菌的

11、还原酶能将TrC还原成红色甲婚的原理,可采用1叹,C间接测定细菌总数法。此法系将TTC溶液加到河底泥中或污水中进行试验,在活细菌还原酶作用下,TTC被还原成红色甲鳍。再以酒精提取这种红色染料。然后用分光光度计测定,与含有已知数目细菌的标准混悬液比较,即可测出样品的细菌总数。与平皿计数法相比较,此法操作更为简便和迅速,不但提高了检出率,而且准确性也较高,更真实地反映了底泥或污水的生物学活性情况。2.大肠杆菌:化学物质的污染可以在河流某一段比较不大的距离内消失,而细菌污染的扩散范围则较大22。关于水体自净过程的许多研究表明,无论什么样的污染,也无论其细菌如何丰富,随着自净过程的进展,终归导致粪便污

12、染指示菌的数目明显下降。许多国家明确规定,大肠杆菌及其变种是一项水体污染指标。从卫生观点来看,大肠杆菌作污染指标具有双重意义,首先它是水体受到人畜粪便污染的可靠指标。而大肠杆菌又可能与肠道病原菌同时排出体外。粪便污染指示生物应在人畜粪便中普遍存在,而在未受污染的环境中又缺乏;其次它在自然界的存活时间应比病原菌长,而又容易鉴定。大肠杆菌基本满足了上述要求,因此它是最有价值的粪便污染指标25,2幻。有关水中大肠菌的测定,曾有多种改进。近来p。、KoB曾提出三种快速简易测定法25(见本刊2975年l期文摘027编者)。这些改良的方法一般不需要转种,节约了许多培养基,只需十余小时就可得出结果,是较好的

13、方法。在水质监测中,大肠杆菌除了作为粪便污染指标外,还可通过以下几种方法来判断水体的污染程度:(1)以大肠杆菌的生物量指数来确定水体污染程度在一定条件下,大肠杆菌的生长受到可利用的有机氮化合物量的限制。因而大肠杆菌的繁殖率可以用来指示水样中这些化合物的含量。而有机氮化合物是严重污染的特征,所以生物量(即在一定时间内细菌繁殖的量)可表明污染水平。由于有机氮化合物只是大肠杆菌繁殖的一个因素,此外还需要其他营养物质。为此,试验时还必需将葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁加人到样品中。同时水样应先经过滤以除去浮游生物并消除混浊。灭菌后,将大肠杆菌接种进去,培养48小时。然后用散射浊度计测定培养物的混浊度(即生

14、物量指数)。有人认为在某些河流中运用这个方法要比生态学方法好。(2)以大肠杆菌测定污水的毒性大肠杆菌能分解葡萄糖产酸。当水中存在有毒物质时,产酸作用将受到抑制。试验是将被检的水样作一系列稀释,分别置于各个试管中,加入葡萄糖和蛋白膝,以满足营养需要。调节PH至7.5,然后将一定量的大肠杆菌混悬液接种进去。在有毒物质作用干扰的情况下,样品的PH值降低速度比对照组慢,这是由于细菌的代谢受到了抑制。据此可以测定废水的毒性。(3)以大肠杆菌来测定某些有毒物质的致癌作用26“:近来有人使用大肠杆菌试验来测定致癌物质。其原理是某些化学物质的致癌作用在于它们能够改变活细胞的DNA。正常的细胞在某种程度上,可以

15、通过修复其DNA的受损部分,来抵抗致癌物质的破坏作用。但是那些修复DNA能力不足的细胞,对于能与其DNA发生反应的物质将表现敏感性增高。DNA聚合酶是参与DNA修复的一种酶,缺乏这种酶的细胞(如大肠杆菌的变异菌株PolA一)与含有这种酶的母细胞(如大肠杆菌的原始菌株PolA+)相比较,对许多已知与细胞DNA发生反应的物质(如放射线、致癌物质等)更为敏感。另一方面,这两种细胞对于一些非致癌物质则表现同等程度的感受性。已经知道,这些非致癌物质仅仅千扰细胞结构,并不干扰细胞的DNA。根据以上原理,采用下述实验方法:将含有DNA聚合酶的大肠杆菌(Pol犷)与缺乏DNA聚合酶的大肠杆菌(PolA一)分别

16、接种在一种加有胸腺碱的液体培养基中培养。然后各取出0.1毫升菌液分别接种在成分相同的琼脂平板上,待琼脂平板表面干燥后,将浸有试验物质溶液的灭菌小圆纸片贴在琼脂表面上,将此平板置37温箱培养7小时,然后测定抑制圈的直径。根据某种物质对PolA十菌株与对Po1A一菌株抑制圈大小的比较,即可鉴别该种物质有无致癌作用。致癌物质的特点是对PolA一菌株的抑制圈明显地大于对Po1A十菌株的抑制圈;而非致癌物质形成的抑制圈的大小两者没有明显差别。Rosenk1anz曾用这种方法鉴定出的致癌物质,进行动物试验,结果证明确有致癌作用。3.醋酸分解菌试验:在水体自净与污水生物氧化处理过程中,使生化需氧量降低的中间

17、产物是以醋酸为主的低级脂肪酸。氧化分解醋酸的醋酸分解菌是使生化需氧量降低的关键因素。当水中有毒物质存在时,就延迟了醋酸分解菌的繁殖,测定醋酸分解菌的繁殖情况,就可以间接确定水中有毒物质的浓度。四、藻类实验由于藻类对水体污染反应十分敏感,因而多年来已广泛利用藻类进行水质生物学监测。关于环境的改变对藻类影响的情况也是多种多样的。例如在河流中,当水温为20oG时,硅藻占优势,30oC时,绿藻占优势;3540时,兰一绿藻占优势。由此可见,热污染可明显地改变水中藻类的品种,使兰绿藻占优势地位。在加拿大的Wabamun湖中,曾研究了热污染对藻类的影响。结果表明,热污染在夏季使藻类减少,在冬季则使藻类增多。

18、在水质生物学监测中较常用的是硅藻及栅藻。因为这些藻类,生长繁殖快,对水质变化较敏感,可通过测定水体中硅藻及栅藻的数量来确定污染的程度。有人曾以栅藻的生物量指数来测定水体中无机氮化合物的含量。一般认为,随着自净过程的进展,水中无机氮化合物的含量不断加。这些可被生物利用的营养物质的含量,可以栅藻试验来测定。将试验水样过滤,以除去浮游生物,然后接种栅藻,并退荧光灯照射。培养10天后,用浊度计测定混浊度(即栅藻的生物量指数)。栅藻的生物量指数可用来判断水中可被利用的营养物质的水平。此外小球藻也常被用作试验。将小球藻置于有毒物质的水中,测定其叶绿素的减少或代谢降低来表示毒性。这是由于水中某些有毒物质(如

19、酚类化合物和除草剂等),能使小球藻的光合作用减弱,降低共叶绿素浓度所造成的。利用有毒物质抑制藻类光合作用测定其溶解氧含量的方法,可测定污染物质的毒性。将藻类通过浮游生物网浓缩、过滤,用蒸馏水冲洗后,放人配有培养基且经消毒的容器中培养两天,使藻类具有一定的生物量。培养好的藻液,放入250毫升碘量瓶中,放满密封。试验组加人一定浓度的被试验物质,对照组不加试剂。试验开始将碘量瓶放入水中,离水面约35厘米处,以500瓦灯泡作人工光源,光照35小时后,测定其溶解氧含量。可用下列公式判断污染物质对藻类的影响: 公式中q值可以是正值或负值,分别表示光合作用抑制率和光合作用刺激率。q值的正负和大小说明污染物质

20、对藻类影响程度。随着水质监测工作的不断发展,水质生物学监测工作也逐步开展起来。当水体受到污染后,不但改变了水体的理化性状,而且也影响了水体中的生物。要全面反映水体污染状况,既要用物理化学方法进行监测,也要采用生物学方法监测。此等方法各有所长,应互相配合、互相补充才能全面了解水体污染的真实情况。五、种子发芽试验以这种方法主要是判断水源是否适用于农业。其原理是:浸泡种子发芽情况及幼芽的生长过程对水中的有毒物质是极其敏感的。通过观察幼芽的生长速度,并结合幼芽与胚轴的生长比例,就可以评价水质。方法是将植物种子浸泡干一定浓度污染物质的水中,然后加盖,并保持在16一20的黑暗环境中。经一段时间后,记录已发

21、芽的种子数,并测定幼芽的长度。将试验样品所得的平均值与对照组比较,如果对照组和试验组的种子几乎全部发芽,两者的生长情况相似,这说明试验水样作为灌溉是适宜的。如果水样中的种子没有发芽或发芽情况很差,则此水不适宜于灌溉。这是一种行之有效而又简便的试验方法,在污水灌田工作中有一定的参考价值。六、河流水质生物监测新方法1 分子生态毒理学方法 分子生态毒理学采用现代分子生物学方法与技术,研究污染物及代谢产物与细胞内大分子,包括蛋白质、核酸、酶等的相互作用,找出作用的靶位或靶分子,从而对在个体、种群、群落或生态系统水平上的影响作出预报,达到微观水平与宏观水平的完美结合,具有很大的预测价值.目前最常用的是把腺苷三磷酸酶(ATPase)作为生物学标志,方法是测定水生生物体内ATPase的活性,并以其活性强弱作为多种污染物胁迫的指标3.此外,Petrovic'等20过测定贻贝(Mytilus galloprovincialisLam.)消化腺上皮细胞中的溶酶体(lysoso