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文档简介

1、 一吉凯基因稳定株（单克隆）构建实验方法1/ 3 一G5嬴J吉凯基因实验概述成功感染同时表达puromycin抗性和目的基因慢病毒的细胞，能在含一定浓度puromycin的培养基中存活，而未感染上慢病毒的细胞则无法存活。因此，在puromycin抗性筛选压力下，稳定表达目的基因的细胞株可被成功筛选获得。如果慢病毒同时带目的基因或针对目的基因的shRNA，感染细胞并用puromycin进行筛选，即可获得稳定表达该目的基因或shRNA的稳定细胞株。对上述稳定细胞株进行稀释培养，挑取单一细胞生长而成的细胞克隆，再进行扩大培养，以获得性状单一、稳定的细胞株。该实验常使用同时表达 GFP的病毒对目的基因

2、的表达进行示踪，以便于单克隆筛选。实验仪器与材料仪器：C02 培养箱(MCO-15A SANYO )倒置荧光显微镜(XDS-100上海蔡康光学仪器有限公司)超净台(EQR/GL-41 ESCO)离心机(TDL-50B 安亭) 隔水式恒温培养箱(GHP-9080 Blue pard)； 通风橱；材料：移液器(P1ml，P200, P20, P10, P2，GILSON ； 4415678，eppendof);吸头(10 卩 l, 100 卩 l , 1000 卩 l, Axygen );盖玻片(24x 60mm);培养板(3599 corning )试剂：培养基(RPMI1640,31800-0

3、12 Invitrogen 或 DMEM, 12800-017 Invitrogen) 胎牛血清(10099-141 Invitrogen)0.25 %胰蛋白酶D-Hanks 液 一G5嬴J吉凯基因实验步骤1. 将目的细胞接种于 48孔板中至70-80%融合度2. 待细胞贴壁后，加入puromycin药物进行空细胞致死最低浓度筛选，一般药物浓度梯度设置为 1ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml （终浓度）进行筛选3. 药物处理48h后细胞全部死亡的最低药物浓度即后续稳定株筛选的药物使用终浓度4. 将目的细胞接种于24孔板中，待细胞贴壁后进行慢病毒感染，感染后第二天，加入puromycin药物筛选，显微镜下观察存活细胞中示踪基因的表达，估算阳性比例。5. 消化后细胞接种于 96或者384孔板中，调整接种的细胞密度为1-5个/孔（按照示踪基因阳性的细胞比例调整接种密度，如90%阳性比例则可调整为1.5个/孔）6. 继续培养两周左右，中间隔天换液，待孔板中细胞长至细胞克隆时，挑取示踪基因表达阳性的克隆，对目的基因进行mRN

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