疾病产生的分子基础中南大学医学分子生物学

1、会计学1疾病产生的分子基础中南大学医学分子疾病产生的分子基础中南大学医学分子生物学生物学第1页/共136页 人体内蛋白质蛋白质分子结构和功能的异常是疾病的发生和发展的主要原因 。第2页/共136页第3页/共136页第4页/共136页2细胞间信号异常细胞间信号异常3细胞内因素细胞内因素第5页/共136页第6页/共136页由于体内外各种因素改变了某基因特定由于体内外各种因素改变了某基因特定的的DNA序列碱基组成和排列顺序，导致序列碱基组成和排列顺序，导致DNA一级结构发生改变，改变了基因结一级结构发生改变，改变了基因结构；其分子机制可以是替换、插入或缺构；其分子机制可以是替换、插入或缺失，因而产生

2、不同的突变类型。失，因而产生不同的突变类型。第7页/共136页分为：分为： 转换转换 （transitiontransition） 颠换颠换 （transversiontransversion）第8页/共136页3. 插入（插入（insertioninsertion）第9页/共136页第10页/共136页(1)(1)碱基置换突变碱基置换突变 ( (substitution mutation)substitution mutation)(二) 不同的基因突变引起不同的遗传效应a. a. 同义突变 (consense mutation)b. 错义突变 (missense mutation)c. 无

3、义突变 (nonsense mutation)d. 终止密码子突变或延长突变e. 起始密码子突变(initiation codon mutation)f. 非编码序列点突变 (point mutation in noncoding sequence)第11页/共136页例如：CUU CUC CUG 亮氨酸第12页/共136页错义突变结果产生异常蛋白质和酶。但也有不少基因由于错义突变产生部分降低活性和异质组分的酶，不完全抑制了催化反应，这种基因称为漏出基因漏出基因（leakygene）。）。有些错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性，不表现出明显的表型效应。 第13页/共136页亮氨酸的密码子亮氨酸

4、的密码子UUA，中间的，中间的U变为变为A这样这样一个碱基变化就会成为（终止密码子）一个碱基变化就会成为（终止密码子）UAA。酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便到此停止。第14页/共136页第15页/共136页 如单纯6谷氨酸缬氨酸，则可产生HbS病，往往造成死亡。但Hb Harlem临床表现却较轻，即73的突变抑制了6突变的有害效应。 第16页/共136页(2) 缺失或插入突变(deletion or insertion mutation) a. 密码子缺失或插入(codon deletion or codon insertion) b. 移码突变(frame-

5、shift mutation) c. 整基因或大片段缺失 (deletion of a whole gene or a large segment) (3) 融合突变(fusion mutation) 细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对， 产生两种含不同等位基因的染色体。 第17页/共136页第18页/共136页(4) (4) 基因突变影响基因突变影响 hnRNA hnRNA 的剪接的剪接 基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。第19页/共136页第20页/共136

6、页21第21页/共136页22第22页/共136页血红蛋白病血红蛋白病镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症第23页/共136页第24页/共136页(1) (1) 人人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构珠蛋白基因结构第25页/共136页(2) (2) 人人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构珠蛋白基因结构第26页/共136页地中海贫血地中海贫血: : 珠蛋白合成珠蛋白合成( (量量) )减少，又称珠蛋减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。白合成障碍性贫血。 第27页/共136页 ( (四四) ) 常见单基因病：常见单基因病：疾病名称疾病名称发病频率发病频率()遗传方式遗传方式致病基因致病

7、基因典型症状典型症状血友病血友病A0.1X连锁连锁凝血因子凝血因子不规则出血不规则出血血友病血友病B0.03X连锁连锁凝血因子凝血因子不规则出血不规则出血杜氏肌营养不良杜氏肌营养不良0.3X连锁连锁肌营养因子肌营养因子肌萎缩肌萎缩贝氏肌营养不良贝氏肌营养不良0.05X连锁连锁肌营养因子肌营养因子肌萎缩肌萎缩脆性脆性X综合征综合征0.5X连锁连锁FMR1智力障碍智力障碍舞蹈病舞蹈病0.5常染色体显性常染色体显性舞蹈病因子舞蹈病因子痴呆痴呆神经纤维神经纤维0.4常染色体显性常染色体显性NF-1,2癌变癌变珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血0.05常染色体隐性常染色体隐性珠蛋白基因簇珠蛋白基因

8、簇贫血贫血镰刀细胞贫血镰刀细胞贫血0.1常染色体隐性常染色体隐性珠蛋白基因珠蛋白基因贫血贫血,局部缺血局部缺血苯丙酮酸尿苯丙酮酸尿0.1常染色体隐性常染色体隐性苯丙氨酸羟基化酶苯丙氨酸羟基化酶无苯丙酮酸代谢无苯丙酮酸代谢能力能力囊性纤维化囊性纤维化0.4常染色体隐性常染色体隐性CFTR进行性肺损伤及进行性肺损伤及其他其他第28页/共136页基因突变类型基因突变类型异常异常Hb氨基酸变化氨基酸变化临床特征临床特征 错义突变错义突变 Hb Shuangfeng 27GluLys(GAGAAG) 不稳定Hb病 Hb S 6GluVal(GAGGUG) 镰刀型细胞贫血 Hb Bibba 136LeuP

9、ro(CUGCCA 不稳定Hb病 无义突变无义突变 Hb Mckees Rocks 145Tyr终止(UAUUAA) 不稳定Hb病 终止密码突变终止密码突变 Hb Constant Spring 142UAACAA- - -地贫 (延长：142Gln- -173UAA) 密码子缺失密码子缺失 Hb Gun Hill 9195缺失 不稳定Hb病 密码子插入密码子插入 Hb Grady 118与119间插入3个氨基酸 无明显症状 移码突变移码突变 Hb Tak 147UAAACU AA- 不稳定Hb病 -158UAA(Thr) 融合突变融合突变 Hb Lepore-Boston 87(Gln)-1

10、16(His) -地贫 Hb Kenya 81(Leu)-86(Ala) -地贫第29页/共136页第30页/共136页第31页/共136页第32页/共136页第33页/共136页第34页/共136页 病原生物基因的体内表达病原生物基因的体内表达 异常的异常的DNADNA甲基化甲基化 hCG5转录起始区低甲基化低甲基化非滋养层细胞hCG 受体结合 cAMP Tumor 第35页/共136页二、二、基因结构和表达与疾病的研究策略基因结构和表达与疾病的研究策略1通过结构分析确定基因变异通过结构分析确定基因变异 核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、 化学切割错配、酶促切割

11、错配化学切割错配、酶促切割错配3通过功能学研究确定致病基因通过功能学研究确定致病基因转基因技术、基因敲除、转基因技术、基因敲除、反义技术、基因诱导超表达反义技术、基因诱导超表达2基因表达水平分析基因表达水平分析差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析第36页/共136页第37页/共136页第38页/共136页第39页/共136页第40页/共136页第41页/共136页第42页/共136页第43页/共136页第44页/共136页第45页/共136页第46页/共136页第47页/共136页第48页/共136页 在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、

12、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differential expression）。第49页/共136页原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3 3端引物端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：第50页/共136页根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5端

13、引物：5端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。第51页/共136页第52页/共136页第53页/共136页第54页/共136页第55页/共136页抑制性抑制性差减杂交差减杂交 ( (SSH)SSH) 流程图流程图第56页/共136页检测组检测组( (Tester)Tester)含目的基因含目的基因cDNAcDNA，加接头，

14、加接头驱逐组驱逐组( (Driver)Driver)不含目的基因不含目的基因cDNAcDNA，不加接头，不加接头*接头接头含含PCR PCR 引物引物正向正向SSH:SSH:易感者易感者( (Tester) +Tester) +不易感者不易感者( (Driver)Driver)易感者特异表达或高表达基因易感者特异表达或高表达基因反向反向SSH:SSH:不易感者不易感者( (Tester) +Tester) +易感者易感者( (Driver)Driver)不易感者特异表达或高表达基因不易感者特异表达或高表达基因 抑制性差减杂交抑制性差减杂交( (SSH)SSH) 第57页/共136页 抑制性差减

15、杂交抑制性差减杂交( (SSH)SSH)第58页/共136页抑制性差减杂交抑制性差减杂交( (SSH)SSH)第59页/共136页抑制性差减杂交抑制性差减杂交( (SSH)SSH)第60页/共136页是一种用于定量、高通量基因表达分析的实是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法验方法(Velculescuetal.,1995)。SAGE原理原理:分分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应和测序，特定的序列标签的

16、出现次数就反应了对应基因的表达丰度。基因的表达丰度。第61页/共136页反转录反转录酶切酶切连接连接测序测序单条测序对单条测序对3040条条EST测序测序分析分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分析、寻找新基因等等基因表达量分析、寻找新基因等等第62页/共136页第63页/共136页第64页/共136页MoMuLVProducingCellsMouseembryosInsertionofviralDNAcontainingtransgeneintoembryosTransgenicMouse第65页/共136页X1-cellpr

17、onuclearstagemouseembryo.PMS+HCGtosuperovulate PregnantFosterMotherOviductTransfer+2-cellstageembryoHoldingPipetteInjectionPipette第66页/共136页第67页/共136页第68页/共136页第69页/共136页+ neomycin+ gancyclovir第70页/共136页第71页/共136页第72页/共136页第73页/共136页第74页/共136页 knockout mouse第75页/共136页第76页/共136页第77页/共136页第78页/共136页转录

18、后基因表达抑制现象的发现转录后基因表达抑制现象的发现CHS GeneCHS Gene矮牵牛花矮牵牛花(Jorgensen,R,1990)第79页/共136页RNAi 现象的发现现象的发现线虫（线虫（C. elegans)C. elegans)(Fire,1998)+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA线线 虫，虫， 果果 蝇蝇微生物，微生物， 植植 物物 第80页/共136页dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表达的机理抑制基因表达的机理siRNAassociatedWithRISCcomple

19、xCellMembrane5POH3TargetmRNA第81页/共136页RNA干扰干扰(RNAinterference,RNAi) RNAi 是将一段双链的RNA 序列导入机体或细胞中,机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到抑制,甚至表达受到完全抑制第82页/共136页第83页/共136页第84页/共136页第85页/共136页第86页/共136页第87页/共136页功能克隆功能克隆氨基酸序列核苷酸序列氨基酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质特异蛋白质目的基因目的基因抗体抗体基因文库筛选基因文库筛选评价评价优点优点 -在单基因性状的基因分离方面仍为在单基因性状的基因分离方面仍为常用常用

20、策略策略缺点缺点 -特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难* -难以分离微量表达基因难以分离微量表达基因 -无法研究无无法研究无蛋白质蛋白质产物的基因产物的基因 -难以进行多基因控制性状的基因分离难以进行多基因控制性状的基因分离第88页/共136页第89页/共136页第90页/共136页疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能 第91页/共136页定位克隆：通过遗传标记定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因，先获得某一表型基因在染色体上的定位在染色体上的定位 ，再在候选区域内选择已知基，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选因

21、，进行致病突变的筛选 ，并获得，并获得cDNA及全基及全基因。因。基本思路基本思路是通过连锁分析原理进行基因是通过连锁分析原理进行基因定位定位。若多态标记与待定基因距离较远若多态标记与待定基因距离较远 ，则它们在，则它们在向子代传递时会发生自由分离向子代传递时会发生自由分离 ，呈，呈“连锁平衡连锁平衡”；反之；反之 ，则不发生自由分离，则不发生自由分离 ，而呈现，而呈现“共分离共分离”现象现象 ，即，即“连锁不平衡连锁不平衡”。据此可在染色体上定。据此可在染色体上定位与某一位与某一DNA标记相连锁的基因。标记相连锁的基因。第92页/共136页1. 将基因定位将基因定位于染色体于染色体 特定区段

22、特定区段2. 候选基因筛候选基因筛选鉴定选鉴定第93页/共136页第94页/共136页第95页/共136页第96页/共136页疾病染色体定位若干候选基因确定目的基因蛋白质功能第97页/共136页第98页/共136页第99页/共136页第100页/共136页101第101页/共136页第102页/共136页随着人类基因组草图测定的完成，随着人类基因组草图测定的完成，宣告了宣告了“后基因组时代后基因组时代”的到来。功能的到来。功能基因组学成为研究的重心，蛋白质组学基因组学成为研究的重心，蛋白质组学的研究受到了空前的关注，也为疾病相的研究受到了空前的关注，也为疾病相关基因的克隆创造了条件。关基因的克

23、隆创造了条件。第103页/共136页同一种细胞或组织，处于不同的状同一种细胞或组织，处于不同的状态（生理与病理等），发育的不同阶段态（生理与病理等），发育的不同阶段，受到外界的不同影响时，都可能使细，受到外界的不同影响时，都可能使细胞中蛋白质的情况产生相应的变化，从胞中蛋白质的情况产生相应的变化，从而产生不同的蛋白质组。蛋白质组学关而产生不同的蛋白质组。蛋白质组学关注和研究的就是这些变化。注和研究的就是这些变化。第104页/共136页第105页/共136页第106页/共136页第107页/共136页第108页/共136页第109页/共136页第110页/共136页第111页/共136页建 库第

24、112页/共136页筛选第113页/共136页第114页/共136页第115页/共136页第116页/共136页第117页/共136页第118页/共136页第119页/共136页第120页/共136页第121页/共136页第122页/共136页第123页/共136页第124页/共136页第125页/共136页单基因病的研究单基因病的研究蛋白质二维电泳：蛋白质二维电泳：蛋白质提取蛋白质提取样品前处理样品前处理一向等电聚一向等电聚焦焦二向二向SDSPAGE凝胶银染及扫描凝胶银染及扫描双向电泳分析软双向电泳分析软件分析件分析差异蛋白质点差异蛋白质点的质普分析的质普分析生物信息数据查询、建立蛋白质数据库生物信息数据查询、建立蛋白质数据库第126页/共136页功能基因组和蛋白质组功能基因组和蛋白质组 基因序列基因序列 编码蛋白质结构预测编码蛋白质结构预测基于结构的同源模建基于结构的同源模建基于蛋白质结构知识基于蛋白质结构知识 基因功能预测基因功能预测药物先导化合物的开发药物先导化合物的开发潜在靶标的识别潜在靶标的识