鼠单抗的改造实用教案

1、1本章(bn zhn)主要内容 概述 C区的人源化-嵌合抗体(kngt) V区的人源化-改型抗体(kngt) 小分子抗体(kngt)第1页/共50页第一页，共50页。2概述(i sh) 鼠源性单抗在临床应用中存在的问题 具免疫原性 激发免疫应答，消弱疗效，产生(chnshng)副作用 与FC片段相关的功能不能有效活化 如活化补体，ADCC,调理作用 半衰期短第2页/共50页第二页，共50页。3概述(i sh) 鼠源性单抗的改造原则 保持原来抗体的特异性与亲和力； 尽量减小其免疫原性。 发展阶段 C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 鼠抗V区与人抗C区组装而成 V区的人源化 改型抗体 小分子抗体

2、第3页/共50页第三页，共50页。4C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 1984 Morrison首次报道依据 90%的人抗鼠抗体反应(fnyng)针对鼠抗C区基本手段从杂交瘤中获得鼠抗V区基因从人B细胞获得人抗C区基因将二者克隆到表达载体转染哺乳动物细胞，进行表达第4页/共50页第四页，共50页。5C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 主要形式(xngsh) 嵌合IgG 嵌合Fab 嵌合F(ab)2第5页/共50页第五页，共50页。6C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 嵌合IgG 目前构建(u jin)的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 如何构建(u jin)？鼠抗基因鼠抗基因人抗基因人抗

3、基因VLCLVHCH1CH2CH3VLCLVHCH1CH2CH3VHCH1CH2CH3VLCL第6页/共50页第六页，共50页。7C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 抗体基因的克隆 鼠抗V区基因的获得 RT-PCR方法 引物设计：依据VH和VL的组成-由4个相对保守(boshu)的FR和3个CDR，设计（注意酶切位点）。 第7页/共50页第七页，共50页。8C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 抗体基因的克隆 鼠抗V区基因的获得(hud) 提取mRNA：从杂交瘤或脾细胞中获得(hud)

4、 RT-PCR法克隆VH和VL基因第8页/共50页第八页，共50页。9C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 抗体基因的克隆 人抗C区基因的获得 C区的选择：依据目的不同选择C区即抗体亚型，如补体活化能力(nngl)， ADCC等 IgG1的补体活化及ADCC作用强于 IgG3，而IgG4没有或很弱。 与Fc受体结合力IgG1和IgG3 最强 IgG1和 IgG4半衰期较长第9页/共50页第九页，共50页。10C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 嵌合(qin h)IgG 目前构建的大多数嵌合(qin h)抗体均为鼠-人IgG 抗体基因的克隆

5、 人抗C区基因的获得 引物设计：C区基因，设计时注意酶切位点 提取mRNA：从B细胞中获得 RT-PCR法克隆C区基因第10页/共50页第十页，共50页。11C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 嵌合(qin h)IgG 目前构建的大多数嵌合(qin h)抗体均为鼠-人IgG 表达载体的构建 构建嵌合(qin h)L链与H链的重组质粒 注意必须是真核表达载体第11页/共50页第十一页，共50页。12C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 嵌合IgG 目前构建(u jin)的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 嵌合抗体的表达 转染哺乳动物细胞进行表达 哺乳动物细胞的选择：骨髓瘤细胞，COS细胞，CHO

6、细胞等。第12页/共50页第十二页，共50页。13几种常用(chn yn)宿主细胞的表达特点 COS细胞 短暂表达(biod)较为理想，几天内即可装配成功 骨髓瘤细胞 最主要的宿主细胞，如NS0 CHO细胞 常用宿主细胞，300-900mg/L第13页/共50页第十三页，共50页。14n嵌合IgG优点(yudin)与不足优点保留了鼠抗的特异性与亲和力基本(jbn)解决鼠抗免疫原性所致的不良反应能有效激活补体及ADCC延长半衰期改善药代动力学特性第14页/共50页第十四页，共50页。15 已批准上市(shng sh)的治疗性单抗2001淋巴瘤CD52人源化抗体(kngt)Campath2000淋

7、巴瘤CD33人源化抗体(kngt)Mylotarg1998RSV感染RSV F蛋白人源化抗体Synagis1998乳腺癌HER-2人源化抗体Herceptin19981999炎症性肠病类风湿关节炎TNF-人-鼠嵌合抗体Remicade1998移植排斥CD25人-鼠嵌合抗体Simulect1997淋巴瘤CD20人-鼠嵌合抗体Rituxan1997移植排斥CD25人源化抗体Zenapax1994冠心病血小板人-鼠嵌合FabReoPr o1995大肠癌17-1A鼠单抗Panorex1986移植排斥CD3鼠单抗OKT3批准日期适应症靶向抗原抗体种类抗体名称第15页/共50页第十五页，共50页。16嵌合

8、(qin h)IgG优点与不足 不足 仍具一定抗原性 分子量较大，组织穿透能力较差 清除较慢 在导向诊断与治疗(zhlio)方面受限第16页/共50页第十六页，共50页。17C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 Fab和F(ab)2嵌合抗体 Fab 克隆鼠抗V区基因 克隆人抗CH1和C基因 重组 构建表达载体 转染宿主(szh)细胞，表达嵌合抗体第17页/共50页第十七页，共50页。18第18页/共50页第十八页，共50页。19C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 Fab和F(ab)2嵌合抗体(kngt) F(ab)2 化学偶联法 通过化学试剂将Fab连接成一个双价抗体(kngt)分子 重组末

9、端修饰法 在Fab的C端额外连接一个Cys残基：效率较低 连接（CPP）3，效率可达70%第19页/共50页第十九页，共50页。20C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 Fab和F(ab)2嵌合抗体 优点 可原核表达 包涵体 ：高效，可达30%，复性难 分泌(fnm)表达：周质腔，可溶有活性，避免降解，降低毒性 成功范例：抗CD3的Fab 700mg/L 人源化抗体HuMab4125-8 Fab 2g/L第20页/共50页第二十页，共50页。21C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 Fab和F(ab)2嵌合抗体 优点 可原核表达 良好的药物载体(zit) 血液清除率高 导向诊断与治疗第21页/

10、共50页第二十一页，共50页。22C区的人源化-嵌合(qin h)抗体 Fab和F(ab)2嵌合(qin h)抗体 缺点 无ADCC,CDC 滞留时间短 仍具一定抗原性第22页/共50页第二十二页，共50页。23V区的人源化 嵌合抗体(kngt)不能完全解决抗原性问题 V区的人源化将鼠抗CDR移植到人抗V区中的FR区。构建策略CDR移植抗体(kngt) 最为普遍CDR序列组成及构象分析,确定策略人源FR模板的重构第23页/共50页第二十三页，共50页。24V区的人源化 构建策略 CDR移植(yzh)的人源化抗体 移植(yzh)策略 完全CDR移植(yzh) 将鼠抗全部6个CDR，克隆到人抗相应

11、FR区上第24页/共50页第二十四页，共50页。25V区的人源化 构建策略 CDR移植的人源化抗体 移植策略 部分CDR移植 外源性CDR仍具潜在抗原性 研究表明，轻链的CDR1,CDR2和重链CDR3是维持(wich)抗原结合所必需。 将必需CDR移植到人抗FR上，得到人源化抗体第25页/共50页第二十五页，共50页。26V区的人源化 构建策略 CDR移植(yzh)的人源化抗体 移植(yzh)策略 SDR转移 研究发现，CDR中的只有特定区域（SDR）参与了表位的识别和结合。 SDR包括暴露在外与表位结合的残基，维持V区构象的残基。 将SDR移植(yzh)到人抗相应位置上，得到人源化抗体第2

12、6页/共50页第二十六页，共50页。27V区的人源化 构建策略 CDR移植的人源化抗体 人源FR模板(mbn)的重构 原则：鼠CDR能正确折叠，保持原来构象 包括：从同源抗体或抗体共同序列中选择人源FR；根据已知信息，确定FR中起关键作用的氨基酸第27页/共50页第二十七页，共50页。28V区的人源化 构建(u jin)策略 CDR移植的人源化抗体 人源FR模板的重构 鼠源FR替换模板的选择 采用统一的人源FR作为替换模板：一般选择人抗最常见的VHIII和VI的框架区作替换模板。 好处：模板信息明确，避免盲目 不足：不易保持鼠抗CDR的天然构象，可能降低或丧失亲和力。第28页/共50页第二十八

13、页，共50页。29V区的人源化 构建策略(cl) CDR移植的人源化抗体 人源FR模板的重构 鼠源FR替换模板的选择 在抗体序列库中搜寻与鼠抗FR最大同源性的人源FR作为替换模板 好处：减少需要更改的氨基酸数目，更好保持CDR需要的空间环境。第29页/共50页第二十九页，共50页。30V区的人源化 构建策略 CDR移植的人源化抗体 人源FR模板的重构 人FR模板的残基变换 FR残基对表位结合也有影响 FR为CDR形成正确构象提供平台 因此，在替换(t hun)时尽量保留与CDR有相互作用，或与抗体亲和力密切相关，或对FR空间结构起关键作用的残基。第30页/共50页第三十页，共50页。31V区的

14、人源化 构建策略 CDR移植的人源化抗体 人源FR模板的重构 人FR模板的残基变换 如何(rh)确定这些残基？ 规范结构法、分子模拟，随即突变，序列分析，抗体库技术等，需晶体数据和三维结构分析数据。第31页/共50页第三十一页，共50页。32V区的人源化 构建策略 鼠抗V区的表面重塑 对鼠CDR及FR表面残基进行(jnxng)修饰或重塑，使其类似于人抗CDR轮廓或人FR式样。 前提：鼠抗V区抗原性源于表面残基 研究表明，表面残基携带绝大部分表位。表面形式的差异是人鼠抗体间的主要差别。 将鼠源性残基替换成人源的，模拟人抗的表面轮廓，逃避人免疫攻击。第32页/共50页第三十二页，共50页。33V区

15、的人源化 构建策略 鼠抗V区的表面(biomin)重塑 对鼠CDR及FR表面(biomin)残基进行修饰或重塑，使其类似于人抗CDR轮廓或人FR式样。 好处：改变的残基少，可减少CDR与FR间的不相容性。 正在完善之中 争论热点：鼠抗引起的人抗鼠抗体反应是由表面(biomin)残基还是由内部残基引起？第33页/共50页第三十三页，共50页。34V区的人源化 构建策略 表位导向的人源化抗体 利用表位导向选择进行(jnxng)鼠抗人源化 要点：首先保留鼠抗H或L链； 特定抗原体外筛选它与人抗L或H链组合成的杂合抗体，找出维持其活性的人抗L或H链； 利用筛出的人抗L或H链，再筛出人抗H或L链，二者组

16、合成完全人源抗体。 基础：建立完整的人抗体库 正在探索，前景广阔第34页/共50页第三十四页，共50页。35V区的人源化 技术方案 鼠抗V区基因的获得 PCR法筛选(shixun)阳性克隆 设计 鼠抗氨基酸序列分析：判断CDR区，特殊FR残基，糖基化位点，其它重要残基第35页/共50页第三十五页，共50页。36V区的人源化 技术方案 设计(shj) 鼠抗氨基酸序列分析 鼠抗V区空间结构的模拟 人抗FR区序列的选择： 固定或同源匹配的FR区 L/H FR来源相同还是不同 选择人亚群一致还是特殊FR 确定选择人FR方案 抗体亚类的考虑第36页/共50页第三十六页，共50页。37V区的人源化 技术方

17、案(fng n) 设计 鼠抗氨基酸序列分析 鼠抗V区空间结构的模拟 人抗FR区序列的选择 鉴别所选FR中公认的比较重要的回复突变 供体和受体序列分析 重新确认FR序列的选择并设计人源化抗体序列 第37页/共50页第三十七页，共50页。38小分子(fnz)抗体 克隆鼠抗V区基因(jyn)，连接而成的抗体第38页/共50页第三十八页，共50页。39小分子(fnz)抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体Single Chain Fv ScFv 由抗体VH、VL基因通过一段连接肽基因拼接后，表达形成的重组蛋白。 具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需Fc段效应功能(gngnng)的实际应

18、用中开展研究和应用。第39页/共50页第三十九页，共50页。40小分子(fnz)抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体Single Chain Fv ScFv基本环节从杂交瘤或脾细胞中提取mRNART-PCR法获得VH和VL基因 设计linker,将其连接在一起克隆到表达(biod)载体基因表达(biod)第40页/共50页第四十页，共50页。41小分子(fnz)抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFv方法要领原则 保持抗体分子的可溶性 设计理想的linker序列linker序列设计的要点(yodin) 长度与性质不应干扰V区的折叠，不干扰对抗原的结合第41页/共50页第四十一页，共50页。42小分子(fnz)抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体单链抗体ScFv方法要领原则linker序列(xli)设计的要点 长度： 不应过短或过长，一般15AA，如 (Gly4Ser)3第42页/共50页第四十二页，共50页。43小分子(fnz)抗体 克隆鼠抗V区基因，连接而成的抗体(kngt)单链抗体(kngt)ScFv方法要领原则linker序列设计的要点 不干扰功能区折叠：残基侧链选择，不宜过 大，如Gly,Ser 亲水性大小，如Thu第43页/共50页第四十三页，共