药物分析 第十一章 抗生素类药物的分析ppt课件

1、第十一章第十一章第一节第一节 概述概述抗生素的定义抗生素的定义抗生素的来源抗生素的来源1. 1. 生物合成发酵生物合成发酵2. 2. 化学合成或半合成化学合成或半合成 是指是指“在低浓度情况下对某些生物的生命活动在低浓度情况下对某些生物的生命活动有特异性抑制造用一类化学物质的总称有特异性抑制造用一类化学物质的总称抗生素质量的复杂性抗生素质量的复杂性 化学纯度低化学纯度低同系物多同系物多异构体多异构体多降解物多降解物多发酵过程不易控制发酵过程不易控制易受污染易受污染工艺复杂，活性组工艺复杂，活性组分易发生变异分易发生变异产品稳定性差产品稳定性差分子构造大多不稳定，降解后疗效分子构造大多不稳定，降

2、解后疗效下降、失效或添加毒副作用下降、失效或添加毒副作用抗生素类药物的质量分析抗生素类药物的质量分析一鉴别实验一鉴别实验1 1、显色反响特殊基团的反响、显色反响特殊基团的反响2 2、光谱法特征吸收、光谱法特征吸收3 3、色谱法保管行为、色谱法保管行为4 4、生物学方法抗菌才干、生物学方法抗菌才干( (二二) )检查检查1 1、常规检查水份、酸碱度等、常规检查水份、酸碱度等2 2、有机和无机杂质检查、有机和无机杂质检查3 3、异常物质的检查异常毒性、热原等、异常物质的检查异常毒性、热原等4 4、其他检查其他共存组分、其他检查其他共存组分含量测定或效价测定含量测定或效价测定1、微生物检定法、微生物

3、检定法稀释法稀释法比浊法比浊法管碟琼脂分散法抑菌圈管碟琼脂分散法抑菌圈灵敏度高、需用量少灵敏度高、需用量少适用范围广纯品、不纯品、知的和新的适用范围广纯品、不纯品、知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价无需分别可一次测定同类型抗生素的总效价无需分别纯化纯化与临床的运用要求一致与临床的运用要求一致操作繁琐、费时费力操作繁琐、费时费力误差较大误差较大效价效价:是指每是指每ml或每或每mg中含有某种抗生中含有某种抗生素有效成分的多少素有效成分的多少是以抗生素对微生物的杀伤或是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为目的来判别效价的抑制程度为目的来判别效价的一种方法一种方法是构造复杂和多组分抗生素效价测是

4、构造复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法定的首先方法2、物理化学法、物理化学法 HPLCLC-MSUV容量法容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少样品用量少1、对构造知或提纯的抗生素、对构造知或提纯的抗生素2、需求规范品对照、需求规范品对照仪器分析方法仪器分析方法分类按构造与性质：分类按构造与性质： 内酰胺类、氨基糖苷类、内酰胺类、氨基糖苷类、 四环素类、大环内酯类、四环素类、大环内酯类、 氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类 林可霉素类、其他抗生素类林可霉素类、其他抗生素类NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核

5、（6-氨基青霉烷酸）第二节第二节 内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 青霉素类青霉素类一、构造与性质一、构造与性质AB头孢菌素类头孢菌素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）RCOABCONSOHNCOOHCH3CH3CH2青霉素青霉素青霉素青霉素G、苄青霉素、苄青霉素NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2氨苄西林氨苄西林氨苄青霉素氨苄青霉素阿莫西林阿莫西林羟氨苄青霉素羟氨苄青霉素NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素头孢氨苄头孢氨苄NONHSC

6、H3COOHOCNH2CH2头孢拉定头孢拉定CH2NH2CONONHSCH3COOH头孢噻吩钠头孢噻吩钠SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONa头孢羟氨苄头孢羟氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2HONSOHNCOOKCH3CH3OCCH2酸性酸性性质性质NaNa与碱金属与碱金属(Na+、K+)成盐成盐 一羧基一羧基 易溶于水易溶于水 与有机碱与有机碱(普鲁卡因普鲁卡因)成盐成盐 难溶于水难溶于水普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2NSO1234567二手性二手性C 87654321NOS(5%头孢唑啉钠溶液

7、头孢唑啉钠溶液 1824)20D 头孢菌素类头孢菌素类 C6 C7青霉素类青霉素类 C3 C5 C6 旋光性旋光性 三三NSO头孢菌素类头孢菌素类 母核有母核有O=C-N-C=C 青霉素类青霉素类 母核无明显母核无明显UV 多数有苯环取代基多数有苯环取代基 NOS UV青霉素钠青霉素钠头孢氨苄头孢氨苄四四内酰胺环内酰胺环 的不稳定性的不稳定性 水溶液水溶液 不稳定不稳定 枯燥纯真枯燥纯真 稳定稳定 不稳定不稳定性要素性要素四元环张力大四元环张力大 酰胺键易水解酰胺键易水解 某些金属离子某些金属离子温度温度失失效效降降解解青青霉霉素素类类酸酸、碱碱、青青霉霉素素酶酶某些氧化剂某些氧化剂青霉素的降

8、解途径青霉素的降解途径NSC H3C H3C O O HONHRO1234567HH NSC H3C H3C O O HONHRO1234567HO H青青 霉霉 素素 酶酶青青 霉霉 噻噻 唑唑 酸酸强强 酸酸 性性 环环 境境NSC H3C H3C O O H1234HNRH O O CN酸酸 性性 加加 热热C H2C O N H C H2C H OCC H3H SC H3CHC O O HH2N+弱弱 酸酸 性性青青 霉霉 醛醛青青 霉霉 胺胺ONORN HC H3C H3H SC O O H青青 霉霉 烯烯 酸酸N H 2O H青青 霉霉 噻噻 唑唑 酸酸 酰酰 基基 羟羟 胺胺 酸

9、酸H gC l2青青 霉霉 酸酸与含水量和纯度亲密相与含水量和纯度亲密相关关青霉素的降解产物青霉素的降解产物青霉素酶青霉噻唑酸青霉素酶青霉噻唑酸强酸性环境青霉酸强酸性环境青霉酸弱酸性环境青霉烯酸弱酸性环境青霉烯酸 强酸性强酸性-加热青霉醛加热青霉醛 强酸性强酸性-加热加热/青霉素酶青霉素酶-重金属青霉重金属青霉胺胺失效失效降解降解头孢菌素类头孢菌素类酸、碱、胺类酸、碱、胺类内酰胺酶内酰胺酶 二、二、K+、Na+反响反响一一鉴别鉴别 焰色焰色鲜黄色鲜黄色 + 醋酸氧铀锌醋酸氧铀锌黄黄 Na+ 焰色焰色紫色紫色 + 0.1%四苯硼钠四苯硼钠 + HAc白白 K+二呈色反响二呈色反响1. 羟肟酸铁反

10、响羟肟酸铁反响 -内酰胺类内酰胺类NaOH HClNOHH内内酰酰胺胺类类呈色呈色羟肟酸衍生物羟肟酸衍生物Fe3+/3H+2、 与与H2SO4 - HNO3反响反响亮亮黄黄红红棕棕黄黄色色头头孢孢噻噻肟肟钠钠头头孢孢噻噻吩吩钠钠头头孢孢氨氨苄苄 HNOSOH头孢菌素类头孢菌素类NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH23. 茚三酮反响茚三酮反响蓝蓝紫紫色色氨氨基基茚茚三三酮酮 - -氨基氨基4. 双缩脲反响双缩脲反响-内酰胺类内酰胺类 CONH紫紫内酰胺类内酰胺类碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜 开环分解开环分解5. 与变色酸与变色酸-硫酸反响硫酸反响活泼活泼“-CH2-青霉素青霉素阿莫西林阿莫西

11、林氨苄西林氨苄西林HCHOCHSOH ”羰羰基基侧侧链链含含“分解分解变色酸变色酸显色显色NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2 变变色色酸酸阿阿莫莫西西林林HCHOSOH150缩合缩合色色褐褐6. 与重氮苯磺酸反响与重氮苯磺酸反响橙橙黄黄色色重重氮氮苯苯磺磺酸酸 OHHC巧合巧合酚羟基酚羟基头孢哌酮头孢哌酮7. 与铜盐反响与铜盐反响 CuSOHAc头头孢孢氨氨苄苄橄榄绿色橄榄绿色NaOH专属反响专属反响三沉淀反响三沉淀反响1. 遇酸遇酸白白青青霉霉素素青青霉霉素素钠钠青青霉霉素素钾钾 H青霉素的青霉素的碱金属盐碱金属盐的溶解性的溶解性2. 有机胺盐反响有机胺盐反响1重氮化重氮化

12、- 巧合反响巧合反响 青青霉霉素素普普鲁鲁卡卡因因普普鲁鲁卡卡因因青青霉霉素素 H重氮化重氮化-巧合反响巧合反响红红 芳伯氨基芳伯氨基C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCH+C2H52CH2NH2H2NCOOCH2CH2N普鲁卡因普鲁卡因普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素NCH2CH2OOC2C2H5N+Cl-N2C2H5COOCH2CH2NNH2HClNaNO2 2与三硝基苯酚反响与三硝基苯酚反响 三硝基苯酚三硝基苯酚二苄基乙二胺二苄基乙二胺苄星青霉素苄星青霉素NaOH二苄基乙二胺二苄基乙二胺光谱法光谱法四四1、 UV法法A,Emin,max,%1cm1 光谱图光谱图样

13、品、分解产物样品、分解产物头孢氨苄头孢氨苄 max = 262nm青霉素青霉素V钠钠 A280nm/A264nm = 1.301.502、 IR法法117401815 cmVOC116901710 cmVOC-内酰胺环内酰胺环酰胺酰胺3、 NMR法法 利用不同构造的原子核在利用不同构造的原子核在D2O中中有有不同的不同的NMR光谱进展鉴别光谱进展鉴别JP以吸收峰频率对峰强度进展作图以吸收峰频率对峰强度进展作图 主要研讨原子核的磁化性质及其在主要研讨原子核的磁化性质及其在外磁场中的运动规律外磁场中的运动规律色谱法色谱法五五1、 TLC法法对照品对照法对照品对照法和和斑斑点点颜颜色色比比较较供供试

14、试品品对对照照品品相相同同条条件件fR2、 HPLC法法Rt比比较较供供试试品品对对照照品品相相同同条条件件三、杂质检查三、杂质检查 药物药物 检查工程检查工程 检查方法检查方法 头孢他啶头孢他啶 聚合物聚合物 HPLCHPLC法法 头孢曲松钠头孢曲松钠 头孢哌酮钠头孢哌酮钠 头孢噻肟钠头孢噻肟钠 头孢呋辛酯头孢呋辛酯 有关物质和异构体有关物质和异构体 HPLCHPLC法法 头孢氨苄头孢氨苄 有关物质有关物质 反相反相TLCTLC法法青霉素钾钠青霉素钾钠 吸收度吸收度 紫外分光光度法紫外分光光度法 1. 1.头孢他啶聚合物的测定头孢他啶聚合物的测定 固定相：葡聚糖凝胶固定相：葡聚糖凝胶G-10

15、G-10 40120m 40120m 流动相流动相A A：3.5%3.5%硫酸铵的硫酸铵的0.01mol/L0.01mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 流动相流动相B B：水：水 对照品溶液：头孢他啶对照品对照品溶液：头孢他啶对照品 100g/ml 100g/ml1 1系统适用性实验：系统适用性实验： 实际塔板数和拖尾因子用实际塔板数和拖尾因子用0.1mg/ml0.1mg/ml蓝色葡聚蓝色葡聚糖糖20002000、流动相、流动相A A测定；反复性用对照品溶液、测定；反复性用对照品溶液、流动相流动相B B测定。测定。 N N不低于不低于900900，拖尾因子，拖尾因子0.751.50.751.5

16、，峰面积，峰面积的的RSDRSD应小于应小于5.0%5.0%。2 2测定方法测定方法 进样供试液，用流动相进样供试液，用流动相A A；进样对照液，；进样对照液，用流动相用流动相B B。以外标法计算，含头孢他啶聚合。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超越物以头孢他啶计不得超越0.3%0.3%。2.2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：固定相：ODSODS 流动相：流动相：0.2mol/L0.2mol/L磷酸二氢铵磷酸二氢铵- -甲醇甲醇62:3862:38 1 1头孢呋辛酯头孢呋辛酯2-2-异构体的制备：头孢呋辛酯异构体的制备：头孢呋辛酯对

17、照品对照品+ +流动相流动相 头孢呋辛酯头孢呋辛酯2-2-异构体。异构体。2 2系统适用性实验：各异构体之间的系统适用性实验：各异构体之间的R1.5R1.5，以，以 头孢呋辛酯头孢呋辛酯A A异构体计算异构体计算n1500n1500。 3异构体：异构体： 相对保管时间相对保管时间 1-被测物被测物 2-规范物规范物异构体异构体 相对保管时间相对保管时间 判别判别B异构体异构体 0.85 供试液谱图中供试液谱图中A异构体的峰面积异构体的峰面积A异构体异构体 1.0 与与A、B异构体峰面积和之比应异构体峰面积和之比应 为为0.480.55。 2112RRttr异构体异构体A A异构体异构体B B头

18、孢呋辛头孢呋辛3.3.头孢氨苄中有关物质的检查头孢氨苄中有关物质的检查- -反相反相TLCTLC法法 固定相：活化后的硅胶固定相：活化后的硅胶G G板置板置5%5%V/VV/V正十四正十四 烷的正己烷溶液中，展至顶部，烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干凉干 展开剂：展开剂：0.1mol/L0.1mol/L枸橼酸枸橼酸-0.2mol/L-0.2mol/L磷酸氢磷酸氢二二 钠钠- -丙酮丙酮120120：8080：3 3 供试液：本品供试液：本品 50mg/ml 50mg/ml 对照液对照液1 1：本品：本品 0.5 mg/ml 0.5 mg/ml 对照液对照液2 2：-苯甘氨酸苯甘氨酸 0.5 m

19、g/ml 0.5 mg/ml 对照液对照液3 3：7-7-氨基去乙酰氧基头孢烷氨基去乙酰氧基头孢烷酸酸 0.5 mg/ml 0.5 mg/ml结果判别：供试液如显杂质斑点，与对照液结果判别：供试液如显杂质斑点，与对照液2 23 3位置一样上所的斑点比较，其颜色不得位置一样上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑更深；如显其他杂质斑 点，与对照液点，与对照液1 1所所显的主斑点比较，其颜色不得更深。显的主斑点比较，其颜色不得更深。4.4.青霉素钠钾的吸收度检查：青霉素钠钾的吸收度检查： 供试液供试液 1.80mg/ml1.80mg/ml， 结果判别：结果判别：A280A280不得大于不得大

20、于0.100.10三、三、 含量测定含量测定HPLCHPLC、碘量法、汞量法、酸碱滴定法、可、碘量法、汞量法、酸碱滴定法、可见紫外分光光度法等见紫外分光光度法等 IINaOH头头孢孢菌菌素素族族青青霉霉素素族族水解水解 H碘量法碘量法一一1. 原理原理水解产物水解产物 OSNaNaIOSNaI定量过量定量过量剩余剩余-内酰胺类内酰胺类反响分两步进展：反响分两步进展：1. 水解反响水解反响 (按化学计算量进展按化学计算量进展)2. 氧化氧化-复原反响复原反响 (无固定的量关无固定的量关系，受温度、系，受温度、PH值和时间等要素值和时间等要素影响，应严厉控制反响条件并采影响，应严厉控制反响条件并采

21、用规范品平行对照测定用规范品平行对照测定)例例注射用普鲁卡因青霉素注射用普鲁卡因青霉素 含量测定含量测定 取装量差别项下的内容物，精细称取装量差别项下的内容物，精细称取约取约0.12g，置，置100ml量瓶中，加水使溶量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精细量取解并稀释至刻度，摇匀，精细量取5ml，置碘瓶中，加置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液1ml放置放置20分钟，再加分钟，再加1mol/L盐酸溶液盐酸溶液1ml与醋酸与醋酸-醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精细，精细参与碘滴定液参与碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，密塞，摇匀，在摇匀，在2025暗处

22、放置暗处放置20分钟，用分钟，用硫代硫酸钠滴定液硫代硫酸钠滴定液0.01mol/L滴定，滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消逝；另精细量取供强力振摇，至蓝色消逝；另精细量取供试品溶液试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸，置碘瓶中，加醋酸-醋酸醋酸钠缓冲液钠缓冲液pH4.55ml，精细参与碘滴，精细参与碘滴定液定液0.01mol/L15ml，密塞，摇匀，密塞，摇匀，在暗处放置在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定分钟，用硫代硫酸钠滴定液液0.01mol/L滴定，作为空白。同时滴定，作为空白。同时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算用青霉素钠对照品同

23、法测定作对照，算出供试品的含量。出供试品的含量。V样样空空V样样对照液对照液+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴+碱碱+酸酸+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴 V对空对空V对对2. 方法方法供试液供试液+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴+碱碱+酸酸+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴 空白实验空白实验A A、消除样品已降解产物的干扰、消除样品已降解产物的干扰B B、消除样品中其他耗费碘的杂质的干扰、消除样品中其他耗费碘的杂质的干扰C C、消除碘挥发呵斥的误差、消除碘挥发呵斥的误差 以未经水解的样品作空白测定以未经水解的样品作空白测定空白空白样品样品I2Na2S2O3I-I2 采用规范品平行对照测定

24、采用规范品平行对照测定A A、可消除温度、可消除温度、pHpH、操作、环境等条件、操作、环境等条件的影响的影响B B、使本法测定结果与微生物检定法一致、使本法测定结果与微生物检定法一致3. 条件条件1弱酸性弱酸性 pH4.5碱碱 I2 IO3- + I-酸酸 普鲁卡因与碘在酸性条件普鲁卡因与碘在酸性条件 下会产生复盐沉淀下会产生复盐沉淀2温度温度 2426温度温度38 未水解的供试品亦耗费碘未水解的供试品亦耗费碘3水解时间水解时间以水解以水解20分钟后的耗碘量最大分钟后的耗碘量最大4反响时间反响时间反响反响20分钟后，耗碘量随时间的分钟后，耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误变化较小，可

25、减小含量测定的误差差4. 特点特点1灵敏度高灵敏度高样品样品 : 碘碘 = 1 : 82反响条件、实验操作要求高反响条件、实验操作要求高V对、对、V对空对空V样、样、V样空样空1份含量份含量加试剂次序、反响时间、滴定速度一样加试剂次序、反响时间、滴定速度一样5. 计算计算原料原料%100 平平均均装装量量）（）（含含量量样样对对对对对对空空样样样样空空DUWUCVVVVO汞量法汞量法二二1. 原理原理SHROH 青青霉霉素素族族水解水解HgRS ）（青霉素族青霉素族 Hg .pH碱性水解产物碱性水解产物青霉噻唑酸，青霉噻唑酸，进一步水解产进一步水解产物青霉胺物青霉胺2. 方法方法 总总样样VN

26、OHgHNONaOH 醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液pH4.6滴定滴定水解水解 降降空空醋醋酸酸盐盐缓缓冲冲液液VNOHg pH4.6滴定滴定样样品品 以未经水解的样品作空白测定以未经水解的样品作空白测定例例青霉素钠青霉素钠 含量测定含量测定 取本品约取本品约50mg，精细称定，加水，精细称定，加水5ml溶解后，加溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置，摇匀，放置15分钟，加分钟，加1mol/L硝酸溶硝酸溶液液5ml，醋酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水及水20ml，摇匀，照电位滴定法，摇匀，照电位滴定法(附录附录 A),用铂电极为指示电极，汞用铂电极为指示

27、电极，汞-硫酸亚汞电极硫酸亚汞电极为参比电极，在为参比电极，在3540，用硝酸汞滴，用硝酸汞滴定液定液(0.02mol/L)缓慢滴定，缓慢滴定，控制滴定过程约为控制滴定过程约为15分钟，不计第分钟，不计第一个等当点，计算第二个等当点时耗费一个等当点，计算第二个等当点时耗费滴定液的量。每滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于相当于7.128mg的总青霉素的总青霉素(按按C16H17N2NaO4S计算计算)。 另取本品约另取本品约0.5g，精细称定，加水，精细称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完，振摇使完全溶解，在室温下，立刻用硝酸

28、汞滴定全溶解，在室温下，立刻用硝酸汞滴定液液(0.02mol/L)滴定，终点判别方法同上滴定，终点判别方法同上. 每每1ml硝酸汞滴定液硝酸汞滴定液0.02mol/L相当于相当于7.128mg的降解物按的降解物按C16H17N2NaO4S计算计算。 总青霉素的百分含量与降解物的百分含量总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素的含量。之差值即为青霉素的含量。3、 讨论讨论1以第二次滴定突跃为终点以第二次滴定突跃为终点 电位法指示终点电位法指示终点 2反响摩尔比反响摩尔比 1 : 13空白实验空白实验 消除已降解产物干扰消除已降解产物干扰4优点优点 不需规范品不需规范品%WFTV%WF

29、TV% 空空空空样样样样含含量量4、 计算计算%FTWVWV% ）（含含量量空空空空样样样样 精细称取含水量为精细称取含水量为0.5%的青霉素的青霉素钠钠0.0502g，按药典方法测定总青霉素含，按药典方法测定总青霉素含量时，用去硝酸汞滴定液量时，用去硝酸汞滴定液(0.02021mol/L)6.97ml。另精细称取上述样品。另精细称取上述样品0.5013g，按药典方法测定降解物含量时，用去硝按药典方法测定降解物含量时，用去硝酸汞滴定液酸汞滴定液(0.02021mol/L)1.33ml。以干。以干燥品计算，求样品中青霉素的含量。燥品计算，求样品中青霉素的含量。例例青霉素钠青霉素钠 含量测定含量测

30、定 .T %. %. 三三1、 原理原理青霉噻唑酸青霉噻唑酸青霉素类青霉素类NaOH钠盐钠盐OHNaClHClNaOH （剩剩余余）-内酰胺类内酰胺类-内酰内酰胺环的不胺环的不稳定性稳定性2、 方法方法 供供试试液液内内酰酰胺胺类类OHNaOH定量过量定量过量 HCl回滴回滴中和中和加加NaOHNaOH中和中和 %WFTVV% 样样空空含量含量3、讨论讨论1水解前先中和溶剂和样品水解前先中和溶剂和样品2加热时防止吸收加热时防止吸收CO2 CONaNaOHCO不能使酚酞变红不能使酚酞变红3空白实验校正空白实验校正(消除消除Na2CO3干扰干扰)4特点特点 简便快速简便快速 不适用于有残留酯的产品

31、不适用于有残留酯的产品四可见四可见- -紫外分光光度法紫外分光光度法原理：利用青霉素的降解产物青霉烯酸在原理：利用青霉素的降解产物青霉烯酸在320 nm320 nm360 nm360 nm处有剧烈吸收特性，并且处有剧烈吸收特性，并且该降解产物与该降解产物与Cu2+Cu2+或或Hg2+Hg2+构成稳定并易于构成稳定并易于测定的配位化合物，从紫外分光光度法测测定的配位化合物，从紫外分光光度法测定。定。硫醇汞盐法硫醇汞盐法酸水解铜盐法酸水解铜盐法羟肟酸比色法羟肟酸比色法nmCupHA 青青霉霉烯烯酸酸青青霉霉素素族族水解水解1、 酸水解法铜盐法酸水解法铜盐法1原理原理稳定剂稳定剂JP青霉素族青霉素族

32、酸性降酸性降解产物解产物2方法方法标标样样枸枸橼橼酸酸硫硫酸酸铜铜标标准准液液供供试试液液AAnmA 320H+ 3特点特点实验条件随各药物稳定性不同而定实验条件随各药物稳定性不同而定规范品对照法规范品对照法2、 硫醇汞盐法硫醇汞盐法1原理原理青青霉霉烯烯酸酸硫硫醇醇汞汞盐盐青青霉霉素素族族 HgCl咪唑咪唑nmmax 青霉素族青霉素族催化剂催化剂2方法方法对照品法对照品法标标样样咪咪唑唑硼硼酸酸缓缓冲冲液液标标准准液液供供试试液液AAHgCl 2pH 9%WWAA%对对照照品品样样标标标标样样 3讨论讨论a. 咪唑催化的水解产率高，硫咪唑催化的水解产率高，硫 醇汞盐稳定醇汞盐稳定3hb. 侧

33、链有侧链有-NH2时，需加醋酐先时，需加醋酐先 将其乙酰化后才干发生上述将其乙酰化后才干发生上述 反响反响4特点特点A、简便快速、简便快速B、用规范品对照，重现性良、用规范品对照，重现性良 好，好，RSD1%3、 羟肟酸比色法羟肟酸比色法Fe3+/3H+红色红色-内酰胺类内酰胺类 HClNOHH内酰胺类内酰胺类羟羟肟肟酸酸衍衍生生物物HPLCHPLC法法内标法校正因子内标法校正因子外标法外标法特点特点 快速、高效、灵敏快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好专属性强、重现性好 一法多用鉴别、检查、含测一法多用鉴别、检查、含测哌拉西宁哌拉西宁 原料药原料药 含量测定含量测定色谱条件色谱条件 用十八烷

34、基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇醇0.2mol/L0.2mol/L磷酸二氢钠溶液磷酸二氢钠溶液1010氢氧化四乙氢氧化四乙基铵溶液基铵溶液水水40040050503 3547547用磷酸调理用磷酸调理pHpH值至值至5.55.5为流动相。检测波长为为流动相。检测波长为254nm254nm。生物样本中生物样本中-内酰胺类抗生素的分析内酰胺类抗生素的分析血浆血浆尿样尿样唾液唾液胆汁胆汁生物样生物样本本色谱柱：色谱柱：Hypersil ODS C18 (200 mmHypersil ODS C18 (200 mm4.6 mm, I.D. 4.6 mm, I.D. 5

35、m)5m)样品制备：取血浆样品制备：取血浆200L200L，参与内标，参与内标5L5L，再参与，再参与HCLO4HCLO4，窝旋提取，窝旋提取Internal standard IS第三节第三节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素苷苷苷苷元元糖糖缩缩合合 氨基糖苷氨基糖苷苷元苷元氨基糖氨基糖缩合缩合 链霉素链霉素 双氢链霉素双氢链霉素新霉素新霉素 卡那霉素卡那霉素庆大霉素庆大霉素 巴龙霉素巴龙霉素一、构造与性质一、构造与性质链霉素链霉素链霉胍链霉胍 + 链霉糖链霉糖 + N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺 苷元苷元糖糖链霉双糖胺链霉双糖胺链霉素：链霉素：链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-

36、葡萄糖胺葡萄糖胺OOOOHOOHOHCH3CHOOHCH2OHOHOHHNCH3HNHNCCNHNH2NHH2N巴龙霉素巴龙霉素D-D-葡萄糖胺葡萄糖胺+ +脱氧链霉胺脱氧链霉胺+D-+D-核糖核糖+ +巴龙霉糖巴龙霉糖巴龙胺巴龙胺苷元苷元巴龙二糖胺巴龙二糖胺 糖糖 庆大霉素庆大霉素 糖糖 苷元苷元绛红糖胺绛红糖胺 + 脱氧链霉胺脱氧链霉胺 + 加洛糖胺加洛糖胺 糖糖 ROC R1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺绛红糖胺紫素胺紫素胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺N-甲基甲基-3-去氧去氧-4-甲甲基戊糖胺基戊糖胺庆大霉素庆大霉素C复合物复合物 庆大

37、霉素庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3性质：性质：多与硫酸成盐多与硫酸成盐链霉素链霉素 3 3个个庆大霉素庆大霉素 5 5个个碱性中心碱性中心碱性碱性一一水溶性水溶性溶解性溶解性二二巴龙霉素巴龙霉素 4个个链霉素链霉素 pH57.5庆大霉素庆大霉素 pH212 稳定稳定UV三三稳定性稳定性四四链霉素水解产物反响链霉素水解产物反响五五二、二、 鉴别鉴别 茚三酮反响茚三酮反响一一蓝蓝紫紫色色庆庆

38、大大霉霉素素链链霉霉素素茚茚三三酮酮羟基胺构造羟基胺构造N-甲基葡萄糖胺反响甲基葡萄糖胺反响二二甲甲基基葡葡萄萄糖糖胺胺庆庆大大霉霉素素链链霉霉素素水水解解 N乙酰丙酮乙酰丙酮 OH-吡咯衍生物吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛H+樱桃红色樱桃红色Elson-Morgan反响反响 麦芽酚反响麦芽酚反响三三 链霉素特有反链霉素特有反响响链链霉霉糖糖链链霉霉素素 OH麦麦芽芽酚酚紫紫红红色色 3FeH+分子重排分子重排 四四MolischMolisch反响反响 具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，

39、参后，在盐酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，参与与 萘酚红紫色或蒽酮蓝紫色萘酚红紫色或蒽酮蓝紫色五坂口反响链霉胍的特有反响五坂口反响链霉胍的特有反响 向链霉素的水解产物链霉胍与向链霉素的水解产物链霉胍与NaBrO2反响得产物反响得产物1；8-羟基喹啉也和羟基喹啉也和NaBrO2反响得产物反响得产物2。产物。产物1和产物和产物2再相互作用再相互作用生成橙红色化合物。生成橙红色化合物。六六 24SO反响反响白白 BaSOSOBaH+庆大霉素无庆大霉素无UV吸收吸收nmmax 链链霉霉素素七七 UV法法八色谱法八色谱法 1 1 、TLCTLC法：硫酸庆大霉素的鉴别法：硫酸庆大霉素的鉴别 点样：供试液

40、：展开、凉干、碘蒸气中显色点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色 对照液对照液 判别：供试液与对照液所显斑点的颜色与位判别：供试液与对照液所显斑点的颜色与位 置应一致。置应一致。 点样：供试液点样：供试液 对照液：硫酸链霉素规范品对照液：硫酸链霉素规范品 对照液：硫酸链霉素规范品对照液：硫酸链霉素规范品 + + 硫酸硫酸 新霉素规范品新霉素规范品+ + 硫酸卡那霉素规范品硫酸卡那霉素规范品 断定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小断定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小 应与对照液应与对照液 一样，一样， 对照液应显示分别明晰的对照液应显示分别明晰的3 3个斑点个斑点 否那么实验无效。否那么实

41、验无效。 2 2、HPLCHPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别法：硫酸庆大霉素的鉴别 比较供试液与对照液各组分的保管时间比较供试液与对照液各组分的保管时间三、特殊杂质的检查三、特殊杂质的检查1 1、链霉素中链霉素、链霉素中链霉素B B的检查的检查TLCTLC法法硅胶硅胶G G板运用前需活化、展开剂板运用前需活化、展开剂 甲苯甲苯- -冰乙冰乙酸酸- -甲醇甲醇50: 25: 2550: 25: 25、0.20.2二羟萘的乙醇二羟萘的乙醇2020硫酸混合液硫酸混合液色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的探求色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的探求 对微生物的活性无明显差别对微生物的活性无明显差别毒副

42、作用和耐药性不同毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同发酵菌种不同工艺差别工艺差别C C组分比例组分比例不一致不一致规定控制各组分的相对百分含量规定控制各组分的相对百分含量2 2、庆大霉素、庆大霉素C C组分的测定衍生化后组分的测定衍生化后HPLCHPLC组分组分C C的毒副作用的毒副作用和耐药性与庆大和耐药性与庆大霉素有差别，导霉素有差别，导致产品的效价和致产品的效价和临床疗效临床疗效 .pH吲吲哚哚衍衍生生物物巯巯基基醋醋酸酸邻邻苯苯二二醛醛氨氨基基max = 330nmmax = 330nm1 1衍生化原理衍生化原理 或电化学检测器或电化学检测器或蒸发光散射检测器或蒸发光散射检测器RPHPLC

43、2 2方法方法 规定规定 C1 2550%C1 2550% C1a 1540% C1a 1540% C2a +C2 2050% C2a +C2 2050%3 3计算计算 %AAAAA%ACCCCiiaa 峰面积归一化法峰面积归一化法四、四、 含量测定含量测定链霉素、庆大霉素链霉素、庆大霉素微生物检定法微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培育本法系利用抗生素在琼脂培育基内的分散作用量反响平行线原理基内的分散作用量反响平行线原理的设计，比较规范品与供试品两者的设计，比较规范品与供试品两者对接种的实验菌产生抑菌圈的大小对接种的实验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。，以测定供试品效价的一

44、种方法。第四节第四节 四环素类抗生素四环素类抗生素一、构造与性质一、构造与性质2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R11234567891011122CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1性质性质 两性两性一一1. 与酸、碱均能成盐与酸、碱均能成盐2.强酸或强碱中溶解度强酸或强碱中溶解度 C10酚羟基、烯醇型羟基酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性弱酸性C4C4二甲胺基二甲胺基 弱碱性弱碱性吸湿性吸湿性二二多含结晶水多含结晶水与金属离子生成有色配位化合物与金属离子生成有色配位化合物Ca2+ Mg2+ Fe3+ Al3+ UV具有共轭双键体系吸收波长为长波方向具有共轭双键体

45、系吸收波长为长波方向三三与金属离子络合与金属离子络合四四pH3 7.5 荧光荧光 酚羟基、酚羟基、烯醇基烯醇基不稳定性不稳定性四四 差向异构化差向异构化差差向向金金霉霉素素差差向向四四环环素素金金霉霉素素四四环环素素 pH淡黄淡黄黑黑蓝色荧光蓝色荧光RRRRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410RRRRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410弱酸性环境弱酸性环境ETC差向四环素差向四环素RH3CO HR HN (C H3)2O HC O N H2OO HOO HO HABCD410RR HN (C H3)2O HC O N H2OOO HO HO HA

46、BCD410C H366强酸性环境强酸性环境ATC脱水四环素脱水四环素 碱性下降解碱性下降解异异四四环环素素四四环环素素 OH荧光荧光HOHCONH2OOHOHOOHCH3ON CH3 2RH3COHRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410RRHN(CH3)2OHCONH2OOHOOHOHABCD410CH366O碱性环境碱性环境EATC异四环素异四环素差向脱水四环素差向脱水四环素二、二、 鉴别实验鉴别实验H2SO4反响反响一一黄色朱红色绿蓝深紫色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素42SOHFeCl3反响反响二二褐色褐色橙褐色橙褐色深褐色深褐色红棕色红棕色盐酸多西环素盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸金霉素盐酸四环素盐酸四环素 FeCl含有酚羟基含有酚羟基Cl-反响反响三三白白 AgClAgClHNOnmmax 溶剂：溶剂：1mol/L盐酸盐酸-甲醇甲醇浓度：浓度：0.01mg/mlUV法法四四荧光法荧光法五五土土霉霉素素金金霉霉素素四四环环素素绿色荧光绿色荧光蓝色荧光蓝色荧光黄色荧光黄色荧光 OHUV绿色荧光绿色荧光H+UV具有共具有共轭双键轭双键TLC法法六六正相分配薄层正相分配薄层 色谱色谱IR法法五五参与参与EDTA 抑制痕量金属呵斥的抑制痕量金属呵斥的 拖尾景象拖尾景象三、检查三、检查 4- 4-差向四环素差向四环素ETCE