两类天然产物的抗真菌活性及作用机制研究

1、两类天然产物的抗真菌活性及作用机制研究随着广谱抗生素的大量使用以及器官移植、 放化疗、血液透析等治疗方法的 广泛应用 ,临床免疫缺陷患者的数量急剧增加 , 使得真菌感染的发病率和死亡率 逐渐上升 , 真菌感染已成为临床重要的感染病症之一。目前用于治疗真菌感染的 抗真菌药物主要有唑类、 多烯类、棘白霉素类等 , 然而, 随着抗真菌药物长时间高 剂量的使用 , 真菌耐药性迅速出现并逐渐蔓延。耐药性的出现增加了真菌感染的治疗难度和治疗费用 , 同时, 抗真菌药物本 身的毒副作用也限制了其在临床上的长期使用 , 因此亟需寻找并开发新型的抗真 菌药物和有效的治疗策略来克服真菌感染。天然产物 , 尤其是来

2、源于药用植物的 天然产物 , 是新药开发的重要资源。地衣,是真菌和藻类高度结合的共生复合体 , 有食用和药用价值。龙葵是茄科 茄属的草本植物 ,具有清热 , 解毒,活血, 消肿的功效。研究发现地衣和龙葵中均含有大量结构新颖、 生物活性多样的次级代谢产物。 本课题组从地衣 Lobaria quercizan 的内生真菌 Aspergillus versicolor 中提 取分离得到了一系列苯醚类化合物； 从龙葵全株中提取分离得到了一系列甾体生 物碱类化合物。通过活性筛选发现了多个具有抗真菌活性的天然产物 ,包括 6个二苯醚类化 合物和 3 个甾体生物碱糖苷类化合物 , 其中,二苯醚类化合物 di

3、orcinol D (DD) 和甾体生物碱糖苷类化合物 solasodi ne-3-O- B -D-glucopyra no side (SG) 的抗 真菌活性较好且提取量较多。另外 , 由于白色念珠菌为临床最常分离得到的致病 真菌,因此,本论文以白色念珠菌为主要研究对象,以化合物DD和SG为代表,研究 了二苯醚类和甾体生物碱糖苷类天然产物的的抗真菌活性及其分子作用机理。采用流式细胞仪 , 胞内甘油含量测定 , 透射电子显微镜观察以及实时定量PCF等多种实验检测方法,发现DD能够损伤白色念珠菌的细胞膜,引起白色念珠 菌的高渗透压力；通过DCFH-DA染色，采用流式细胞仪检测和激光共聚焦显微镜

4、观察,发现DD能够引起胞内活性氧（ROS）的积累；通过罗丹明123染色,流式细胞 仪检测,发现DD能够导致线粒体膜电势的增强；通过对线粒体外膜蛋白Tom70观察,发现DD能够导致Tom70分布异常,线粒体功能紊乱。同时研究发现,还原剂 硫脲和线粒体功能抑制剂NaN3均能够部分逆转由DD引起的ROS积累、线粒体膜 电势改变、线粒体功能损伤，并且能够部分抑制DD的杀真菌活性。基于以上结果可推断DD的抗真菌机制为：DD损伤白色念珠菌细胞膜,导致 细胞受到高渗透压力胁迫，激活胞内的HOG!路,增加甘油合成量，缓解渗透压力； 进入胞内的DD刺激线粒体产生大量ROS并超过细胞正常代谢范围,过量的ROS 进

5、一步损伤线粒体功能 , 导致线粒体膜电势增加 , 加速细胞死亡。联合用药是治疗 真菌感染的有效治疗策略。本研究采用棋盘式微量稀释法检测了化合物 DD与氟康唑联合用药的抗真菌 活性，并通过FICI模型， E模型，以及时间-杀菌曲线法对两药的联合效果进行 了评价。实验结果表明,当DD与氟康唑联合用药时,除两株临床氟康唑敏感菌株 11E和11F外,其余8株野生菌株和临床菌株均表现出协同抗真菌的效果,并且DD能够显著逆转临床氟康唑耐药菌株的耐药性。进一步的机制研究发现DD能够显著抑制白色念珠菌对罗丹明123的外排能 力，并且能够显著降低外排泵基因 CDR1的表达量。通过麦角甾醇含量测定以及实 时定量P

6、CF等实验,发现DD能够通过抑制氟康唑靶基因ERG11的表达，降低白色 念珠菌中麦角甾醇含量基于以上结果可推断DD通过以下两种途径逆转氟康唑耐药性：(1)通过抑制 外排泵的功能 , 增加胞内氟康唑含量 , 逆转其耐药性； (2) 与氟康唑协同作用于其 靶基因ERG11抑制麦角甾醇生物合成，进而逆转其耐药性。白色念珠菌是一种条 件性致病真菌 , 其生长具有二相性。当外界环境改变或宿主免疫系统受损时 , 白色念珠菌会由酵母态转向菌丝态 转变。菌丝态因其具有较强的黏附和侵袭能力 ,为白色念珠菌重要的毒力因子。通过XTT检测、显微观察,发现SG能够显著抑制白色念珠菌的黏附、 菌丝形 成以及被膜形成的能

7、力 , 并且其对成熟被膜也有较好的清除作用。在秀丽隐杆线 虫-白色念珠菌感染模型中,SG能够通过抑制白色念珠菌菌丝的形成减弱其致病 性, 提高感染线虫的存活率 , 降低白色念珠菌毒力。Ras1-cAMP-Efg1信号通路是调控白色念珠菌菌丝形成的重要通路 ,采用实 时定量PCF检测,发现SG能够下调此通路中基因的转录水平,同时SG也能够抑制 黏附因子Als3, Hwpl, Eap1的表达。cAMP在菌丝形成过程中起关键作用，外源 补加cAMP能够部分逆转SG对菌丝形成和被膜形成的抑制效果。因此，推测SG降低白色念珠菌毒力机制如下：SG通过降低黏附因子的表达 抑制白色念珠菌的黏附能力；通过下调R

8、as1-cAMP-Efg1通路的转录水平，降低胞 内cAMP含量,抑制其由酵母态到菌丝态的形态转变；通过对黏附和菌丝形成过程 的抑制来降低其被膜形成的能力 , 进而减弱白色念珠菌的毒力。 我们进一步对 SG 的抗真菌机制进行了深入研究。通过对提取分离和化学修饰得到的10个与SG结构类似的甾体生物碱类小分 子的构效关系分析,发现SG结构中的NH和葡萄糖基团对其发挥抗真菌活性起到 关键作用。通过HPLC-MS/M检测,发现不同单糖取代的SG结构类似物中,只有葡 萄糖基团取代的SG能够在胞内和胞外粗酶反应中水解产生大量的苷元solasodine 。同时实验发现 solasodine 虽对野生型白色念

9、珠菌无抗真菌活性 , 但其对某 些外排泵敲除菌株有较强的抗真菌活性。并且激光共聚焦观察发现SG和solasodine 均能够导致白色念珠菌胞内 vacuole 碱化,渗透性增加 ,内容物渗漏 , 最终导致细胞死亡。基于以上结果推断：化合物SG中的NH和葡萄糖基团是其发挥抗真菌活性的 关键活性基团；SG能够在白色念珠菌细胞内水解形成大量苷元solasodine,而solasodine 能够进一步损伤胞内的 vacuole 结构和功能 , 最终导致细胞死亡。 组 蛋白结构修饰能够影响真核细胞基因的转录水平 ,进而影响后续的生理代谢过程。研究表明,组蛋白修饰是近期发现的新型抗真菌药物靶点 ,并且与药

10、物耐药 性相关。我们在念珠菌基因组数据库 (Candida Genome Database) 中找到四个与 酿酒酵母组蛋白去甲基化酶JmjC结构域基因同源且被注释为白色念珠菌组蛋白 去甲基化酶的基因。利用基因同源重组原理 , 对白色念珠菌中的这四个组蛋白去甲基化酶基因分 别进行基因敲除 ,以进一步探究白色念珠菌中组蛋白去甲基化酶与其耐药性的相 关性。通过微量稀释法和平板稀释法检测 , 发现白色念珠菌去甲基化酶基因敲除 后, 其对唑类药物的敏感性显著提高。采用HPLC-MS/M检测,发现基因敲除菌株中麦角甾醇含量明显下降。因此推断,白色念珠菌组蛋白去甲基化酶敲除菌株麦角甾醇生物合成量的减少是其对唑 类药物高敏感性的原因之一。下一步实验将对唑类耐药菌株中的组蛋白去甲基化酶进行基因敲除 ,观察其 耐药性变化 , 以进一步探究组蛋白的去甲基化过程与唑类耐药性之间的关系。本 论文以化合物DD和SG为代表,论述了二苯醚类和甾体生物