固定化酶和细胞

1、会计学1固定化酶和细胞固定化酶和细胞第1页/共44页1、什么是固定化技术和固定化酶2、固定化酶的研究历史3、酶的固定化技术4、固定化酶的特点GoGoGoGo6、细胞、原生质体的固定化，自学5、固定化酶的应用Go第2页/共44页1 什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术第3页/共44页化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续酶的固定化技术和固定化酶第4页/共44页固定化酶的三种形式固定化酶：经提取和分离纯化后的酶固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片 固定化细胞：在一定的空间范围内进行

2、生命活动的细胞 l 优点优点：1.1.不溶于水，易于与产物分离；不溶于水，易于与产物分离；2.2.可反复使用；可反复使用；3.3.可连续化生产；可连续化生产；4.4.稳定性好。稳定性好。l 缺点：缺点：1.1.固定化过程中往往会引起酶的失活固定化过程中往往会引起酶的失活 2. 2.固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻第5页/共44页第6页/共44页本章目录第7页/共44页固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项第8页/共44页第9页/共44页第10页/共44页根据载体材料和方法的不同，可分为：根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法：凝胶包埋法：将酶

3、或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。 半透膜包埋法：半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化

4、酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等 第11页/共44页 首先被采用包埋法的酶有： 固定化胰蛋白酶固定化胰蛋白酶 固定化木瓜蛋白酶固定化木瓜蛋白酶 固定化固定化 淀粉酶淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙甲叉双丙烯烯酰胺，丙烯酰胺，引发酰胺，丙烯酰胺，引发剂剂第12页/共44页海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用其滴入凝固浴中（常用CaClCaCl2 2 溶液溶液），使海藻酸钠中的），使海藻酸钠中的Na+Na+，部分被，

5、部分被Ca2+Ca2+所取代而形成由多价离子交联所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控颗粒大小可实时监控第13页/共44页脂质体包裹酶第14页/共44页结合法 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。的固定化方法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法：离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换键结合法。离子键结合

6、法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有剂。常用的有DEAE-DEAE-纤维素纤维素、TEAE-TEAE-纤维素纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶等。等。 共价键结合法：共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素纤维素、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶、葡聚糖葡聚糖凝胶凝胶、甲壳质甲壳质、氨基酸共聚物氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物甲基丙稀醇共聚物等。等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基酶分子中可以形成共

7、价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化载体活化，第15页/共44页第16页/共44页交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较颗粒较

8、小小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短使用，以取长补短。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。第17页/共44页酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶本章目录酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联第18页/共44页NHC H2C H2OPOOONH2OHOO HO HO HOPOOOC H2C HC H26R1-2Mana1-2Mana1-6R2Mana1-4Glca1-Plas

9、ma membraneProteinEthanalamine phasphate bridgeGlycanInositol第19页/共44页第20页/共44页本章目录第21页/共44页乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶世界上第一种工业化生产的固定化酶。世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基

10、酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。 第22页/共44页泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-AlaDL-乙酰氨基酸拆分第23页/共44页淀粉液化液淀粉酶糖化酶糖化液喷雾干燥氢化还原结晶异构酶粉状葡萄糖山梨醇结晶葡萄糖果葡糖浆果糖42%葡萄糖55%低聚糖分离混合高果糖浆果糖浆果糖80-90%果糖55%葡萄糖39%低聚糖世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶的放线菌细胞用6065热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化

11、酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。 第24页/共44页2021-12-4K. Buchholz, et al.(Germany) ,2005; 2008This is the largest process performed with about 1500 t of immobilized enzymes producing a glucosefructose syrup (HFCS, high fructose corn syrup) with more than 10 million t of product (dry matter) per year 1220 t (

12、dry substance, d.s.) per kg of biocatalyst with a half-life of 80150 days. Reactor dimensions typically are 1.5 m diameter and 5 m height of fixed bed bioreactors, with operation at 5860 C第25页/共44页第26页/共44页填充床反应器连续生产(R)-1,3-丙二醇 b. 固定化生物催化剂在异丙醇-水溶液体系中进行不对称氢转移生物还原 n底物底物4-羟基羟基-2-丁酮丁酮 5%n产物产物(R)-1,3-丁二醇

13、丁二醇 49.5 g/ln光学纯度光学纯度 99%e.e. n转化率为转化率为 99% n反应器稳定工作反应器稳定工作 500 hn反应器的生产率约为反应器的生产率约为 750 mg/h/10 ml (催化剂催化剂) （Nobuya Itoh,2007） a. 固定化E. coli 细胞第27页/共44页生物催化不对称氧化还原CO2合成甲醇 （ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ） n四种酶四种酶，包括甲酸、甲醛、包括甲酸、甲醛、乙醇和谷氨酸脱氢酶乙醇和谷氨酸脱氢酶 共固定化在一种颗粒上共固定化在一种颗粒上n辅酶辅酶NADH固定在另颗粒

14、上固定在另颗粒上n向两种固定化颗粒的悬浮液向两种固定化颗粒的悬浮液中通中通CO2气体进行反应气体进行反应n实现了辅酶的内部循环实现了辅酶的内部循环n该固定化系统表现出较好的该固定化系统表现出较好的循环使用的稳定性循环使用的稳定性 酶和辅酶酶和辅酶共固定化共固定化E1E2第28页/共44页江苏江苏常茂生化常茂生化常茂生化常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的整细胞催化转化生产L-(+)-酒石酸，年生产规模6000吨，占世界市场15%，改变了传统从葡萄酒石提取的单一技术局面。 获得高酶活固定化细胞，单元反应柱生产能力增加50%，酶反应半衰期8个月以上，并且是世界上最大型的凝胶包埋固定化微生

15、物细胞生产装置 大型固定化细胞装置大型固定化细胞装置 底物产物第29页/共44页30浙江鑫富浙江鑫富 利用戊二醛交联固定化的链孢霉菌细胞(含内酯水解酶) 催化拆分DL- 泛解酸内酯，已实现D-泛酸钙和D-泛醇的大规模产业化年产量5000吨，占世界市场44%5000L生物反应器交联固定化菌体在反应02040600102030405060708090批次水解率（%）OOOH+消旋化DL-PLOOOHL-PLOHOHCOOHD-PAOOOHD-PL内酯化D-泛解酸内酯水解酶浙江浙江鑫富药业鑫富药业第30页/共44页n 原料利用率提高：底物近100%转化为目标产物，原子经济性大幅提高。n 节能减排效果

16、明显：有机溶剂用量减少约59.3%、“三废”排放减少约39.4%。n 产品质量提高： ee 值大于99.5%（化学法99.0%）。抗抑郁药帕罗西汀手性中间体左旋帕罗醇的合成抗抑郁药帕罗西汀手性中间体左旋帕罗醇的合成FCHO1)2)ONHOOFNOHCH3FNOHCH3OOOOHOOO3)HClFNNHCH3HOOOenzymeEtNH2EtFNNHCH3OEt1)HCl2)BF3/NaBH4H2O2/LiOH3)OOOOOO浙江浙江九洲药业九洲药业工程菌，酯酶；大孔树脂固定化酶；重复使用20次以上（Industrial Engineering Chemistry & Research

17、(2010, 2008a, 2008b)第31页/共44页酵母展示脂肪酶在生物合成中的应用油，脂肪酸、己酸等油，脂肪酸、己酸等甲醇，乙醇，糖醇等甲醇，乙醇，糖醇等芳香酯，表面活性剂，芳香酯，表面活性剂，生物柴油等生物柴油等第32页/共44页酵母展示脂肪酶在短链芳香酯合成的应用无水体系中不同酸醇摩尔比对合无水体系中不同酸醇摩尔比对合成己酸乙酯的影响成己酸乙酯的影响无溶剂体系下酶催化合成芳香酯无溶剂体系下酶催化合成芳香酯酯酸醇摩尔比6h转化率12h转化率24h转化率乙酸丁酯乙酸异戊酯 乙酸叶醇酯乙酸香叶酯 丁酸乙酯丁酸异戊酯丁酸叶醇酯丁酸香叶酯己酸乙酯己酸丁酯己酸己酯己酸香叶酯庚酸乙酯辛酸乙酯 1

18、：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：225.3%22.0%25.0%9.5%72.9%70.1%80.8%19.0%88.0%56.3%42.4%18.8%69.1%24.1%40.5%40.1%53.6%38.1%88.5%90.4%84.6%76.9%90.2%88.9%72.2%60.2%87.7%55.0%79.0%85.9%85.7%85.7%89.4%92.3%84.6%90.5%90.0%90.6%84.0%90.6%88.0%87.9%无水体系下合成芳香酯无水体系下合成芳香酯第33页/共44页第34页/共44页第35页/共44页葡萄糖

19、醌H2O葡萄糖酸氢醌葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶氢醌 醌2H2ePt铂电极葡萄糖酶电极l葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。 第36页/共44页第37页/共44页脲电极Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电

20、极感应。此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3第38页/共44页一些常见的酶电极底 物酶电 极5腺苷酸5腺苷酸脱氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脱氢酶Pt过氧化物过氧化氢酶Pt (O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt (O2)D-氨基酸D氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt (H2O2)琥珀酸琥珀酸脱氢酶Pt (O2)硫酸酯芳基硫酸酯酶Pt硫氰酸硫氰酸酶CN硝酸盐硝酸盐还原酶/ 亚硝酸盐还原酶NH4+亚硝酸盐亚硝酸盐还原酶NH3（气体）草酸草酸脱羧酶CO2（气体）青霉素青霉素酶pH乳酸乳酸脱氢酶；细胞色素bPt，Fe（CN）-4L氨基酸脱羧酶CO2L精氨酸精氨酸酶NH4+L天冬酰胺天冬酰胺酶NH4+本章目录第3