槲寄生抗氧化活性研究(钟文武)

1、民间药用植物扁枝榊寄生多糖体外抗氧化活性研究钟文武i彭文书i余正云2陈毅坚广 （云南尺族大学化学与生物技术学院，云南，昆明650500） （西双版纳职业技术学院，云南，西双版纳，666100） 摘 要：采用水提醇沉的方法对两种不同寄主扁枝懈寄生中的多糖进行了提取，粗步纯化， 测定了其中多糖的含量，并利用分光光度法研究了两种样品中的粗多糖对fenton反应产生 逐自由棊、邻苯三酚自氧化产生超氧阴离了自由基以及dpph.的清除作用，同时利川硫代 巴比妥酸（tba）分光光度法研究了两种样品粗多糖对011诱发卵磷脂脂质过氧化损伤的抑制 作用。实验结果表明，两种样品粗多糖对h由基清除作用，对卵磷脂脂质过

2、氧化损伤也有一 定的抑制作用。关键词：扁枝懈寄牛，粗多糖，抗氧化活性study on the antioxidative activity of polysaccharide from viscumarticulatum of folk medicinal plantszhong wenwu peng wenshu yu zhengyun chen yijian *（school of chemistry and biotechnology, yunnan nationalities university, kunming 650500） （xishuangbanna vocational a

3、nd technical insitute）abstract： polysaccharide from viscum articulatum of different hosts was extracted and partially purified with hot water and ethanol precipitation, and the content of crude polysaccharide determined scavenging effects of crude polysaccharide on active radicals such as hydroxyl r

4、adical generated by fenton reaction, superoxide anion radical generated by autoxidation of 1,2,3-bcnzcnctriol and dpph were tested by means of spectrophotometry; simultaneously, the inhibitional effects of crude polysaccharide on the lecithin lipid peroxidation were observed through thiobarbituric a

5、cid spectrophotometry. the results showed that the crude polysaccharide from viscum articulatum of different hosts has some scavenging effects on active radical and inhibitional effects on the lecithin lipid peroxidation to some extent.key words: viscum articulatum crude polysaccharide antioxidation

6、懈寄生为桑寄生科（厶"伽辰csw）懈寄生属（v/sm加）半寄生常绿植物，常寄生于桑科、 茶科、山毛淺科、芸香料、蔷薇科、豆科、壳斗科等29科50余种植物上。其作为我国传 统的药用植物，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、治疗胃病、腰腿痛、原发性高血压、妇女妊娠 胎动不安、咳嗽、冻伤等药理作用。扁枝删寄生viscum articulatum是榊寄生属植物, 主要分布在云南、贵州、广西、广东、湖南、湖北等省，在云南主耍分布在丽江、辿庆、怒 江、普洱、版纳、禄劝等地，经调杏表明，丽江的纳四族主要用其来治疗风湿病；迪庆和怒 江的傑傑族则主要用來治疗胃炎、肝炎、肠炎；普洱江城的哈尼族则将其与其它药物配

7、伍使 用。近年来，国内外对懈寄生开展了大量的研究，不仅对其分类鉴定做了大量工作，还对其化基金项目：云南省教育厅科学研究基金项h ： 2010y428o“通讯作者：陈毅坚（1966）,女,副教授，研究方向：民族药资源开发和利用。emai 1:1243074486qq. com 学成分及药理作用进行了分析评价，经研究表明懈寄生多糖具有提高免疫力、保护动物免受放 疗化疗损伤的作用、抗炎症、抗癌等作用，但对蒯寄生多糖的抗氧化活性研究较少。鉴于此，本文将对两种不同寄主的懈寄牛的多糖进行体外清除自山基及抗氧化作用的实 验研究，为揭示该药材的活性机理及为所含多糖的开发利用奠定基础。1. 仪器与材料1.1仪器

8、uv-1800紫外分光光度计；7200型nj见分光光度计；旋转蒸发仪；电子天平；离心机。1.2试剂与材料扁枝附寄生，寄主分别为花椒树（无患子h sapindales芸香科rutaceae花椒加zant hoxylum）和板栗树（壳斗科fagaceae栗屈castanea板栗c. mollissima）,标本采自云南迪庆 维西，经鉴定后保存于云南民族大学化学与生物技术学院实验室，实验材料60°c干燥粉碎, 过60目筛，保存备用；dpph、邻苯三酚、卵磷脂、蔥酮、衙萄糖、硫酸、乙醇等试剂均 为分析纯。寄为花椒树的扁枝懈寄牛标记为：样品1:寄为板栗树的扁枝懈寄牛.标记为: 样品202. 实

9、验方法2样品粗多糖的提取与处理取样品粉末5.00 g,按料液比1 : 30加入蒸僻水，微波提取lomin,离心获得样品粗多糖 提取液，石汕艇萃取去除叶绿素，提取液用95%的乙醇沉淀过夜，离心获得沉淀示复溶， 加入3倍体积的scvag试剂脱蛋白三到五次后，作为供试液备用。2.2提取液粗多糖含量的测定2.2.1授佳测定波长的选择及标准曲线的制作准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸饰水并定容至100ml,使用时稀释10倍（ 0.1mg/ml）；称取o.lg恵酮溶于loomlso%硫酸中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶中，冰箱 保存。分别取0.6讥 葡萄糊标准溶液和样品多糖溶液，加入蔥酮试剂5ml,

10、用蒸憎水补足6ml, 沸水浴加热10min,冷却后在500-800nm范围内扫描，得到最大吸收波长。分别取稀释后的葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、l.oml于试管中,加入5ml m酮试 剂，补足6ml,摇匀后沸水浴加热lomin,取出冷却，在最佳吸收波长下测定其吸光度，以 吸光度为纵坐标，葡萄糖含虽为横坐标绘制标准曲线。2.2.2提取液中多糖含量测定与计算样品提取液稀释100倍后按221方法进行显色测定其吸光度，平行测定三次，并按标准曲 线方程计算出提取液中多糖的含量，计算相对标准偏差（rsd）。2.3粗多糖抗氧化性能的研究2.3.1清除释基白由基活性的测定采用fenton产生的

11、瓮白由基可使番红花红褪色的特点来研究样品多糖提取液对拜基白由 基的清除能力。取 0.05 mo" l ph 7.4 的磷酸缓冲溶液 1.0ml, 40 ng/ml 番红花红 1.0 ml, 0.945 mmol/l edta-fe（ii）（新鲜配制）1.0 ml，样品粗多糖溶液0.5 ml、3 %h2o21.0ml （新鲜配制），混合 后在37 °c水浴屮反应30 min后在520 nm处测定吸光度as。空口组以0.5ml蒸饰水代替样品 测定吸光度a。,对照组以1.5ml蒸憎水代替h2o2和样品测定吸光度a,用3.5ml蒸憎水代替 帝红花红、edta fe（ii）、h2o2

12、 样站,1.0ml磷酸盐缓冲溶液调零。并按下式计算清除 率：a - a清除率（%）二xloo%a - a。2.3.2对轻口由基诱导的脂质过氧化的抑制作用同取1 ml卵磷脂溶液(取200 mg卵磷脂溶解于30 ml0.05 mol/ lph 7.4 pbs，冰浴震荡)，加 入ph 7.4pbs缓冲液1.0ml,不同浓度的样品粗多糖溶液1.0 ml ,2.5 mmol/ledta -fe( ii) 1.() ml,混匀后于37 °c水浴中反应45 min,再加入28 %(w/ v)的tca2.0 ml ,1 %(w/ v)的 tba 1.0ml，混匀后置于100 °c沸水浴中加

13、热1() min，冷却后在532nm处测定吸光度a样，用 pbs缓冲液调零，空口管用pbs缓冲液代替样品测吸光度a。并按下式计算抑制率：抑制率(%) =a°aff x 100%a。2.3.3清除dpph自由基活性的测定thio】分别取各浓度的样品多糖溶液2ml于试管中，加入2. 0ml 2x lomol/l的dpph溶液， 混匀静置30min后,用溶剂作参比测定其在517nm处的吸光度a，同时测定2.0ml dpph 溶液与溶剂混合后的吸光度a。，以及不同浓度的粗多糖溶液2.0ml与2.0ml溶剂混合后的吸 光度aj(背景吸收)。根据以卜公式计算清除率：a _ a清除率( ) =1-

14、 -l-2 x 100%a。2.3.4对邻苯三酚自氧化的抑制作用参照文献11略作修改进行，在试管中加入0伽1样品粗多糖溶液和4. 2ml0. 05mol/l. ph 为& 2的tris-hcl缓冲液，加入0. 4ml2. 5 mniol/l邻苯三酚，混匀示立即在324nm (木实验测定 的最佳吸收波长)下测定吸光度a样,用0. 4m 10. 05mol/l> ph为& 2的tris-hcl缓冲液代替样 品粗多糊溶液作为对照a对照，以扫描时间为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制抑制曲线。a _a抑制率(%)=妙样也'x100%a对照3. 结果与分析3.1多糖含量测定最佳波

15、长的选择衙萄糖标准溶液和样品粗多糖溶液用蔥酮硫酸法显色后，在波长500-800范围内扫描，扫 描结果表明：葡萄糖标准品和样品粗多糖都在623mn处有最大吸收，本实验采用623nm测 定波长。3.2葡萄糖标准illi线的制作按221的方法进行，标准曲线冋归方程为：y = 0.0076*x-0.0718"=0.99906,由此可知在20-100 ug/ml的范围内有较好的线性关系。3.3多糖含量的测定按2.2.2的方法对两样站样液进行三次测定，结杲表明经捉収、沉淀、去蛋口后样站1、 样品2提取液粗多糖含虽分别为：7.927mg/ml、&765mg/ml,测定方法rsd分别为：1.

16、394%、 0.902%,二者均小于2%,表明方法有较好的精密度。3.4样站粗多糖清除自山基结果341清除耗基自由基活性的测定结果10020 - /10 -/0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2concentration(mg/ml) 样品1; 样品2图.1样品多糖清除疑基口由基作用fig 1 scavenging effect on hydroxyl radicals of sample ' s polysaccharide由图可知，样品1粗多糖浓度=1. omg/rnl时对由fenton反应产生的疑基h由基保持有较 好的清除

17、率，最人清除率可达到81. 18%,而样品2粗多糖对拜基白由基的清除率为75%,相 对于样品1有所偏低，但二者都对0h有一定的清除作用，说明不同寄主的扁枝榊寄生中 的多糖作为其中的抗氧化组分，其活性随着寄主的不同而有所差异。3.4.2对梵a市基诱导的脂质过氧化的抑制作用结果05050505055 4 4 3 3 2 2 1 1234concentrat ion (mg/ml) 样晶1；-样品2图.2样品多糖抑制脂质过氧化作用fig.2the inhibitive effect on lipid peroxidation of sample ' s polysaccharide由图可知，

18、当样品粗多糖浓度为2mg/ml时对脂质过氧化的抑制作用最大，抑制率达到 46.65%,但随着多糖浓度的增人，抑制率反而出现下降趋势，没有出现较好的剂量-效应关 系，这可能是实验用的多糖溶液不是纯品的缘故；对于样品2粗多糖，当英浓度达到6mg/ml 时，其对脂质过氧化的抑制率达到49.65%。分析表明不同寄主的扁枝懈寄生多糖对脂质过 氧化都有一定抑制作用，且抑制作用差界不大。1000.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0concentration (mg/ml)a样品1; 样品2图.3样品多糖清除dpph 口由基活性figure3 scavengin

19、g effect on dpph of sample ' s polysaccharide结果表明，样品1粗多糖和样品2粗多糖都对dpph自由基有较好的清除作用，在测定 的范围，二者对dpph ti由基的清除作用随浓度的增人而增大，有较好的量效关系，当二 者浓度为2.0mg/ml吋，对dpph自由基的清除率达到最大。3.4.3对邻苯三酚自氧化的抑制作用结果3空 s s -4-0.6n/ml-50.8n«anl； -6t omg/rol -7-2. on/ml；图.5样品1粗多糖对邻苯三酚h氧化的抑制作用figure 5 the inhibitive effect on aut

20、oxidation of benzenetriol结果表明，样品1粗多糖対邻苯三酚自氧化的抑制作用不强，在粗多糖浓度1.0mg/ml 的条件下,抑制率w11.57%。当粗多糖浓度为2.0mg/ml时,抑制率为31.65%,说明其对邻 苯三酚自氧化产生的超氧负离了自由基的清除作用不好，在低浓度情况下对h氧化反应有一 定的促进作用，但抑制作用没有随着浓度的增大而出现人的变化，这可能是由于所用多糖不 是纯品导致。t ise s-1-0. 2ng ml;-2-空白-3-0. 4mg ml ;-4-0. 6mg /bl-5-0.8mg ml：-6-l omg/nl -7-2 ong ml图.4样站2粗多

21、糖对邻苯三酚自氧化的抑制作用figure 4 the inhibitive effect on autoxidation of benzenetriol由图可知，样品2粗多糖对邻苯三酚具冇一定的抑制作用，在低浓度的调节下，此懈寄 生样品粗多糊对邻苯三酚自氧化反而有一定的促进作用，随着多糖浓度的增人，对其白氧化 的抑制作用也随之增大，当浓度达到2.0mg/ml时，対自氧化的抑制率为41.84%。讨论：懈寄牛中含有丰富的多糖及糖蛋口类物质，具有一定的抗炎症、抗癌作用小，木实验研究 结果表明，扁枝懈寄生多糊对oh、ch等口由基都有一定的清除作用，对质脂过氧化也 冇一定的抑制作用，h不同寄主的扁枝橱寄生随着寄主的不同形态也出现较大差异，其中所 含的多糖对自市基的清除作用也岀现了不同，这一方面是rti于扁枝懈寄牛与不同寄主共牛所 产生的多糖种类不同导致的，另一方而可能是山于不同寄主的扁枝删寄4:所含的活性多糖的 虽不一样导致的。扁枝懈寄生多糖对人体内常见的自由慕的清除作用可以减小自由棊对胃肠 道黏膜的损伤，从而降低组胺类物质的浓度，起到一定治疗胃炎、肠炎的作用；同时，也可 以减小自山基对人体组织细胞损伤，减轻骨、软骨的破坏，从而起到一定的消炎和治疗风湿 的作用。扁枝懈寄牛在云南的少数民族地区被认为是珍贵的药丿ij植物，具药川机理和药川价 值有