药用微生物实训指导

1、实训一大肠菌群的检查取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1： 10的 供试液lml（含供试品o.lg或0. lml） 1： 100的供试液lml（含供试品0olg或 0. 01ml）、1： 1000的供试液lml（含供试品0001g或0. 001ml）,另取1支胆 盐乳糖发酵培养基管加入稀释液lml作为阴性对照管。培养1824小时。胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠 菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824小时。若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态特

2、征不符或为非 革兰阴性无芽他杆菌，判该管未检出人肠菌群；若平板上生长的菌落与表2所列 的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽抱杆菌，应进行确证试验。表大肠菌群菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝 琼脂呈紫黑色、浅紫色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表 面光滑，湿润麦康凯琼脂鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润确证试验从上述分离平板上挑选45个疑似菌落，分别接种丁乳糖发酵管 中，培养2448小时。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则 判未检岀人肠菌群。根据大肠菌群的检出管数，按表3报告lg或lml供试品中的大肠菌群数。表3可能的大肠菌群数表

3、各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数 n （个/g 或 ml）0. lg 或0. lml0. olg 或0. 01ml0. oolg 或0. 001ml+>103+102<n<103+10<n<102<10注：+代表检出大肠菌群；一代表未检出大肠菌群。枪样ii乳常胆纭发酵借i24h 土 2h37%： ± ip伊红矣茲琼月旨平板大戲呷祈阴性 i益告i18 一 24h 37忙 2%：图大肠菌群的检验程序图实训二细菌总数的测定(-)计数法的检验计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试 品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。我们采用平

4、皿法常规法和培养基稀释法都是平皿法。供试液通过离心沉淀以后也可用平皿法 检查。采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续23个稀释级的供试液。取供试液lml,置直径90mm的无菌平肌中(培养基稀释法，则将lml供试 液均匀分注入2个或以上的平皿屮)，注入15-20ml温度不超过45°c的溶化的营 养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉月东葡萄糖琼脂培养基，混匀， 凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。阴性对照试验 取试验用的稀释液lml,置无菌平皿中，注入培养基，凝固,倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。培养和计数 除另有规定外，细菌培养48

5、小时，逐日点计菌落数，一般以 48小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72 小时的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至57天进行菌落汁数并报 告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的 平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小 于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。一般营养琼脂培养基用丁细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母 菌计数；酵母浸出粉月东葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营 养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别 点汁霉菌和酵母菌、细菌

6、菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或 玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的每菌和酵母菌数或 营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结 果。含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸 岀粉月东葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30300之间、後菌平 均菌落数在30100之间的稀释级，作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。(1) 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀 释倍数的值报告菌数。(2) 当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比

7、值(比值为高稀 释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值)而 定。若比值不大于2,以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比 值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出 现比值人于5,或高稀释级的菌落数人于或等于低稀释级的菌落数等界常情况 时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。(3) 当各稀释级的平均菌落数均小于30,以最低稀释级的平均菌落数乘以稀 释倍数的值报告菌数。(4) 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落牛长， 但平均菌落数小于1时，以vl乘以最低稀释倍数的值报告菌数。伊红美蓝培养基蛋白月东

8、10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20-30g蒸憎水1000ml2%伊红水溶液20ml0.5 %美蓝水溶液13ml储备培养基的制备先将琼脂加至900ml蒸憎水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白月东，混匀使之溶 解，再以熬懾水补足至1000ml,调整ph为7.27.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳 糖，加入伊红和美蓝溶液，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115°c灭菌 20min,贮存于冷暗处备用。乳糖胆盐发酵培养基：20g蛋白月东、5g牛胆盐及10g乳糖溶于1l水中，校正ph为7 .4,加25ml混甲酚紫指示 液(0.4 g/l),分装每管20ml,并放入一个小倒管，115°c高压灭菌20 min。乳糖发酵培养基：将20 g蛋白豚和10g乳糖溶于1l水屮，校正ph至7.4,加入25m