nfкb和相关细胞因子在急性胰腺炎中作用的临床研究

1、nf-kb和相关细胞因子在急性胰腺炎中作用的临床研究中文摘要目的：初步观察急性胰腺炎患者（ap）血清中核因子kb （nf-kb）和相关细胞 因子肿瘤坏死因子-a（tnf-a）>白介素6（il6）、白介素-8（il-8）>白介素10（il10） 的变化特点，并进行相关性分析，探讨nfkb及相关细胞因子在ap中的作用。方法：选取53例符合首次急性胰腺炎诊断标准的患者，入院后分别于第1天、 5天、10天采用elisa法检测血清中tnfa、il6、il-8. il-10浓度;提取外周血 单个核细胞（pbmc）,采用免疫细胞化学定位法检测nfkb的表达。健康体检者20 名作为对照组。将ap患

2、者分为轻症急性胰腺炎组（map组）28例和重症急性胰腺 炎组（sap组）25例，与对照组进行比较,并对tnf-a> il-6> il-8> il-10分别与 nf-kb进行相关性分析。结果：1. map患者nfkb、tnfa、il-6. il-8水平在第1天可见升高最明显，第5天下降，与同时段对照组比较有显著性差界（pv0.05）,第10天map组各因子平 均水平降至正常水平。2. sap组中nfkb、tnfct、il-6、il8水平在第1天可见明显升高，第5 天升高更明显，与同时段对照组比较均有显著性差异（pv0.05）。第5天sap组与 同时段map组相比升高有统计学差异

3、（pv0.05）。第10天sap组各因子平均水 平降至正常水平。3. map患者il-10水平较同时段对照组比较无显著性差异（p>0.05）,sap组中il-10 在第1天明显升高，第5天更高，第10天升至最高水平（p<0.05） o第5天及第10 天sap组中ilj0高于map组，差异有统计学意义（pvo.05）。4. sap组nf-kb与tnf-a> il-6. il-8均有正相关性（p<0.05）,与il-10无明显相关性（p>0.05）。结论：1. ap组患者nf-kb> tnf-a> il-6> il-8水平均有早期升高，sap组第5天

4、升高最明 显。sap组nfkb与tnf(x、il6、il8均有正相关性。2. nf-kb可通过转录调控tnf-a. il -6、il- 8等促炎因子，在ap的病程发展中发挥重要的作用。3. sap组患者il10早期升高，第10天升高最明显。抗炎因子il10参与了 sap早 期病程的发展。关键词：nfkb；细胞因子；急性胰腺炎；临床研究作 者：金燕 指导老师：陈卫昌clinical analysis of nuclear factor-kb and the relatedcytokings in patients with acute pancreatitisabstractobjectives

5、: we aimed at synchronously examining the course of nuclear factor-xb (nf-kb) and related cytokines- interleukin (il) 6, il-& il-10, and tumor necrosis factor a(tnf-a) in acute pancreatitis (ap). the results of this study and correlation analysis could explain the mechanism of ap induced by nf-k

6、b and related cytokines.methods: nf-kb、interleukin (il) -6, il-& il-10, and tnf-a were measured on admission and at days 1, 5, and 10 in 53 patients admitted with first attack of ap. also we took normal health person who took the healthy examination as the control. ap cases were divided as the m

7、ild acute pancreatitis (map) 28 cases and severe acute pancreatitis (sap) 25 cases. the relationship of nf-kb and related cytokines were analysised by statistics method.results:1. nf-kb,tnf-ajl-6 and il-8 levels were significantly higher in the map patients at days 1, however, lowed down at the day

8、5 (p<0.05) .then decreased to normal level at day 10 as compared with the control.2. nf-kb,tnf-a,il-6 and il-8 levels were significantly higher in the sap patients at days 1, and peaked at the day 5 (p<0.05) , however, decreased to normal level at day 10 as compared with the control. nf-kb,tnf

9、-a,il-6 and il-8 levels were significantly higher in the sap patients at days 5 than in the map patients(p<0.05).3 il-10 levers didn't have significant differences as compared with the control in the map patients (p>0.05), but which were increased at the beginning and peaked at the day 10

10、as compared with the control in the sap group (p<0.05). nf-kb,tnf-ajl-6 and il-8 levels were significantly higher in the sap patients at days 5 and 10 than in the map patients(p<0.05).4. the statistics analysis were shown that nf-kb had the positive correlation with cytokines tnf-a,il-6jl-8 (p

11、<0.05) in the sap patients. however, no correlation withinil-10 (p>0.05).conclusion:l nf-kb,tnf-ajl-6 and il-8 levels were higher in the early time of ap patients,and were significantly higher in the sap patients at days 5. nf-kb had the positive correlation with cytokines tnf-ajl-6jl-8 in the

12、 sap patients-2. nf-kb which plays a pivotal role in the pathogenesis of acute pancreatitises a transcription factor of the major proinflammatory genes- tnf-a, il-6, il-8.3. il-10 levels were higher in the early time of sap patients,and were significantly higher at days 10. anti-inflammatory factor

13、il-10 participated in the sap early course.keyword: nf-kb, cytokine, ap, clinical studywritten by： jin yansupervised by： chen weichang刖 行1材料和方法41研究对象42ap相关诊断标准43治疗54实验仪器、设备和试剂55实验方法66统计学方法8结果91 一般资料92各组并发症93pbmc屮nf-kb表达的动态变化94血清炎症因子浓度变化105相关性分析14讨论171 nf-kb 与 ap172抑制nfkb活化与ap的转归183il-10 与 ap19结论20参考

14、文献21综述26nf-kb活化在急性膜腺炎发病机制屮的研究进展26中英文对照缩略词表37攻读硕士学位期间公开发表的论文39致谢40冃ij s急性月夷腺炎(acute pancreatitis, ap)包括轻症急性胰腺炎(mikl acute pancreatitis, map)和重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, sap)。sap 占 ap 的 15%30% 左右。sap病情凶险复杂，进展迅速，死亡率高达15%20%"。目前对于ap发 病机制的研究共有以下相关学说:一胰腺自身消化学说1、一 胰腺微循环障碍学说ii、一氧 自由基损伤学说ii、一 细胞凋

15、亡学说ii和一细胞因子学说i。其中一细胞因子学说i是目前 研究的热点15-61 o核因子kb( nuclear factor- kappab, nf-kb)是一种多极性细胞转录 因子，可调控多种炎症因子的基因转录。大量动物实验显示，ap发病过程中， 胰腺本身及远处器官、组织及细胞内nfkb活化程度均显著增强，同时伴有炎症细 胞因子水平上调，证实ap时伴有nf-kb的活化。nf-kb是一种转录因子，与机体免疫、炎症、细胞再生、凋亡等过程密切相关, 可调控多种炎症因子的基因转录【。p50/p65异源二聚体是nf-kb活化的最常见形 式。静息状态卜，nf-kb与kb抑制蛋白家族(inhibitory

16、 protein of nf- kb, ikb)结 合，呈现非活性状态，滞留于细胞浆中，不具有基因转录作用。当细胞受到细胞外信 号刺激时，多种因素如病毒、内毒素、氧自由基等均可通过不同途径使其激活。各种 刺激信号通过细胞膜上的受体或配体将信号传至胞浆，激活ikb的激酶复合体(ikb kinase, ikk),使ikb磷酸化并降解，nfkb与ikb解离后迅速从胞浆移位至细胞 核，与调控细胞因子表达的基因启动子或增强子上的特异性序列结合，调节相关基因 转录心。己有多项研究证实了 nfkb的活化参与了 ap的发病发展过程。在动物实验中， 正常脏器组织中几乎测不到nfkb的活性，但sap大鼠模型中，腆

17、腺本身及远处器 官组织细胞内nfkb活化程度均显著增强，同时伴有炎症细胞因子水平上调在 cckz醇ap模型中，增加胆囊收缩素(cholecystokinin , cck)、乙醇的剂量可 使胰腺nfkb表达增加，并诱导rna中tnfa、il6、单核细胞趋化蛋白1、巨噬 细胞炎性蛋白2、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase , inos)的表达增加。 对cck诱导ap模型的其他研究也发现，nfkb及相关炎症因子均呈不同程度的升 高。向大鼠胰胆管中注射牛磺胆酸钠盐可诱导产生sap模型|，nf-kb活性明盐1小吋后，腺泡和内皮细胞中可发现nfkb p65亚基的核

18、转位。satoh a等也发 现牛磺胆酸盐诱导sap大鼠模型6h后，可检测到腹膜和肺泡单核细胞中nfkb活 化。在结扎大鼠胰胆管导致ap模型的研究中】，可以检测到nfkb活化明显增高, 与假手术组对照相比，nfkb明显活化，并h下游的tnf-a水 平相应增加。腹腔内 大剂量注入l精氨酸(lwginine, arg)诱导大鼠sap模型的研究中也检测到 nf-kb的活化。该实验发现arg与朕腺屮nfkb活化存在剂量时间依赖性。其 tnf-a和il10水平变化亦相同。除了 ap动物模型出现nf-kb活 化，直接注入 nf-kb活性亚单位rela / p65也能诱导ap,chen等,31把rela/ p

19、65直 接注射至大鼠 胰腺管内，结果显示胰腺大多数腺泡细胞中nfkb活化。nf-kb的活化激活了下游多种炎症因子的表达，目前研究发现多种细胞因子、趋 化因子、粘附分子、生长因子、免疫受体、氧化应激相关酶、转录因子、急性吋相蛋 片等许多基因的启动子屮都有功能性nfkb的结合位点。在ap中多种刺激如病 原微生物感染、创伤、缺血缺氧、氧化应急等都可以诱导nf-kb活化。当刺激因素 未能及时清除，其至进一步扩大、增强,nf-kb诱导活性超乎寻常地增加，引起tnf-a. il6、il-8等致炎因子的大量合成与释放。ap中的细胞因子可分为促炎因子和抗炎因子两类。il6是a p最重要的促炎细 胞因子之一，在

20、ap中il6可以与tnf-a等协同，构成炎症介质网络，共同介导炎症 反应的、181 o il- 8是一种中性粒细胞趋化因子，ap早期il- 8 "9】可促使中性粒细 胞的活化及随后的中性粒细胞弹性蛋白酶释放，诱导嗜碱性粒细胞释放组胺，参与免 疫、代谢和急性期反应的调节。il8过度表达可损伤正常细胞和组织，参与肺损伤 的发病机制，导致mof等并发症20,2llo肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor , tnf-a) 由单核巨噬细胞产生，是ap始动因子。tnf-a在ap病情进程中起核心作用，它可 直接作用于胰腺内皮细胞，导致局部出血坏死；也可间接引起白细胞的原位聚集和

21、激 活，释放炎症介质中性粒细胞弹性蛋口酶(primary monosymptomatic nocturnal enuresis, pmne)> paf> 磷脂酶 a2(phospholipase a2, pla2)等导致胰腺持续坏死及 全身并发症】。tnf-a作用于肺泡毛细血管时，可引起肺水肿，诱发ards i231o tnf-a可作用于内皮细胞，激活炎症细胞、上调粘附分子、no和氧自由基等导致组 织损害241o tnf-a激活可使多种致炎细胞因子释放呈正反馈增加i251osap时多种致炎细胞因子会通过tnf-a信号通路活化nfkb,以正反馈调节机 制使nfkb诱导活性继续增加，诱

22、发更大量多致炎因子的生成形成一瀑布样级联 反应ii (waterfall sample cascade reaction )261 ,造成体内炎症反应扩大化，最终导致 以自身性破坏为主要特征的全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, sirs) (271oil-10是ap中一个重要的抗炎因子【，il-10通过抑制il-1和tnf-a水平能降 低ap的严重程度i291oil-10可阻断nfkb活化，在转录水平抑制炎症介质的产生 301o il-10基因的启动子含有与nfkb结合的kb反应元件，从而有助于将nfkb限 制在细胞质中，下调细

23、胞核中nfkb的活性，最终减少或终止炎性细胞因子的生成 (301o目前关于ap的临床研究中，tnf-a> il- k il-6等细胞因子的研究较广泛，但 关于nfkb表达水平的临床研究较少，而nfkb与相关细胞因子表达的相关研究更 少。本课题检测nf-kb和相关细胞因子(如tnf-ail6、il8、il-10)在ap患 者病程第1天、5天、10天的浓度变化，并进行相关性研究，从而分析nfkb及 相关细胞因子在ap病程中的作用。材料和方法1研究对象53例ap为2011年01月至2012年06月期间在无锡市第二人民医院消化内科、 icu收治患者，所有ap患者均符合中华医学会消化病学会胰腺疾病

24、学组2004年制 定的中国急性胰腺炎诊治指南（以下简称指南中的急性胰腺炎诊断标准）3，o 根据诊断标准map患者28例、sap患者25例。并选取正常对照组20例，均来自 健康体检者，排除心、肝、肾等器质性疾病。2ap相关诊断标准入选标准：选择所有ap病例均是首次ap发作，且均于发病后的6小时内收 治入院。排除标准：患有胃癌、肠癌等肿瘤病史、肠道感染、胆囊炎等其他消化道感染性 疾病、急性白血病等血液系统疾病、高血压、冠心病等心血管系统疾病、肺炎、慢性 支气管炎等呼吸系统疾病和红斑狼疮等风湿免疫性疾病的患者均不参加本次研究。2急性胰腺炎（ap）：临床上表现为急性、持续性腹痛（偶无腹痛），血清淀粉

25、酶活性增高n正常值上限3倍，影像学提示胰腺有或无形态改变，排除其他疾病者。 可有或无其他器官功能障碍。少数病例血清淀粉酶活性正常或轻度增高。2.2轻症急性胰腺炎（map）：具备ap的临床表现和生化改变，而无器官功能 障碍或局部并发症，对液体补充治疗反应良好。ranson评分3,或apacheii评分 8,或ct分级为a、b、c级。2.3重症急性胰腺炎（sap）：具备ap的临床表现和生化改变，且具下列之一 者：局部并发症（膜腺坏死，假性囊肿，胰腺脓肿）；器官衰竭；ranson评分23； apacheii评分2 8； ct分级为d、e级。2.4器官衰竭有：休克（收缩压v12kpa）、肺功能不全（p

26、ao 28kpa）肾功能 衰竭（肌酉干177pmol/l）、胃肠道出血（500ml/24h）、dic （血小板10xl09/l）纤 维蛋白原 1 .og/l、纤维蛋白分解产物80|ig/ml、严重代谢紊乱（血钙 1.87mmol/l）。2.5 sirs：凡具有下述2项或者2项以上者可诊断 体温38°c或v36°c；心 率大于各年龄组正常均值加2个标准差；呼吸大于各年龄组正常均值加2个标准差 或paco24.3kpa；白细胞总数12.010九或4.0x109/l,或杆状核细胞10%。3治疗纳入本实骑的所有ap患者入院后均接受常规内科治疗，如禁食、胃肠减压、抗 生素抗感染、奥曲

27、肽（善宁0.3mg静脉维持q12h）抑制胰酶、营养支持、呼吸支持、 血液滤过等。4实验仪器、设备和试剂超纯水系统pall lifescience labph仪beckman电子分析天平ae-100mettlermini protean 3cell 电泳仪bio-rad酶联免疫检测仪clinbio-128setgenesys-2紫外分光光度计spectronic超净工作台苏州净化设备厂dk-8d电热恒温水浴箱上海精宏试验设备有限公司gnp-9080型隔水式恒温培养箱上海精宏试验设备有限公司biofuge 15r型台式高速低温离心机heraeusco2培养箱heraeus正置荧光显微镜olympu

28、suet-1386型超低温冰箱美国revco公司屯热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂heraeus高速冷冻离心机徳国kendro公司lxj- ii离心沉淀机涟水电讯电机厂ldz4-0.8离心机北京医用离心机厂光学显微镜重庆光学仪器厂kh-851旋涡混合器上海环宇仪器厂电热高压蒸汽消毒锅上海1矢疗核子仪器厂pipetman微量加样器法国gilson公司鸽牌微量进样器上海医用激光仪器厂yxq sg41压力蒸汽灭菌器上海华线医用校正仪器有限公司edta真空抗凝试管美国 franklin lakes 公司血液计数仪ac920eo上海医疗仪器厂人il-6 elisa试剂盒美国tpi公司人il8 elis

29、a试剂盒美国tpi公司人il-10 elisa试剂盒美国tpi公司人tnf-aelisa试剂盒美国tpi公司聚左旋赖氨酸涂铺的载玻片北京中杉金桥牛物制剂有限公司磷酸缓冲盐水(pbs)北京中杉金桥生物制剂有限公司鼠抗人nfkb /p65单克隆抗体santa cruz通用型二步法检测试剂盒(pv-6000)北京欣兴唐生物科技有限公司浓缩型dab试剂盒(zli-9031)北京中杉金桥牛物制剂有限公司5实验方法5.1样本采集 所有ap病人在入院第1天、第5天、第10天经肘静脉各采血 10ml,对照组采血一次。取非抗凝血2ml,室温凝固0.5h,离心2500rpm, 4°c, lomin, 收

30、集上清液，分装至lml灭菌eppendorf管后-70°c冻存。检测细胞因子时，用前室 温冻融。5.2 运用梯度离心作用方法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell , pbmc) 清晨经肘静脉采血，肝素化后立即离心(5 min at 1500 rpm,留取全血细胞，在全血细胞屮按1比1加入磷酸缓冲盐水(phosphate buffer solution , pbs)稀释。用尖头吸管轻轻铺于比重1.077淋巴细胞分离液表面，稀释 血与淋巴细胞分离液体积比为2:1,形成清晰界面。台式离心机2000r/min离心20min, 离心后单个核细

31、胞悬于分层液面，呈口膜状。用吸管轻轻将单个核细胞吸入另一管内，pbs 清洗 2 次(1500r/min, 8min)o5.3血nfkb的免疫细胞化学定位法检测 分离得到较纯的pbmc后，在其屮 加入50卩1胎牛血清，混匀后直接涂片于聚左旋赖氨酸涂铺的载玻片，自然晾干后的 pbmc涂片在室温下用分析纯丙酮固定5分钟，再次自然晾干。用3%的过氧化氢溶 液孵化固定好的涂片35分钟，使内源性过氧化物酶活性被冻结，pbs冲洗二遍。 然后,再在pbmc涂片上滴加鼠抗人nfkb /p65单克隆抗体，在37度恒温箱中的湿 盒中孵化60分钟。之后在pbs中洗过二遍后，标本滴加通用型二抗(pv-6000),仍置

32、于37度恒温箱中的湿盒中孵化30分钟。然后再用pbs冲洗二遍，用dab(3,3»二氨 基联苯胺)染色约310分钟。最后用蒸憾水洗涤。二个无关的观察者各自定量化 pbmc细胞核的染色。在细胞核中表达crel者，即显微镜下观察呈棕黄色者被标记 为nf-kb(+)cellso pbmc中nfkb系统的活化水平用所有定量化的pbmc中 nf-kb(+)cells占全部pbmc的百分比表达。中间观察者造成的nfkb(+)cells百分比 的变异小于6%。5.4 血 il-6 、 il-8> il-10 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay

33、, elisa)检测按照试剂盒操作说明进行试骑：(1) 用双蒸水将10x浓缩洗涤液稀释至lx,取5山样品，用样品稀释液作1:1000稀释。(2) 加入标准品、已稀释血清于相应反应板孔中，空白孔中不加任何液体。(3)每孔加 入 anti human il biotin 和 anti human il pod,轻轻混匀 30s,封住板孔，室温 (18°c25°c)下孵育。(4) 洗板：各孔加入洗涤液，反复洗涤5次，每次甩尽板内液体。(5)每孔加入显色 液，轻轻混匀10s,室温孵育20mino (6)每孔加入终止液，轻轻混匀30s, 30min内 用酶标仪在450nm处读od值。

34、(7)以od值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，并在曲线上计算出各个 样本的il浓度值。5.5血tnf-a elisa检测方法 按照试剂盒操作说明进行试验：(1) 用双蒸水将10x浓缩洗涤液稀释至lx,样品作1:1000稀释。(2) 加入5pl标准品、已稀释血清于相应反应板孔中，空白孔中不加任何液体。 每孔加入 200(11 anti human tnf-abiotin,轻轻混匀 30s, 37 度孵育 30mino（4）洗板：各孔加入350卩1洗涤液，反复洗涤5次，每次甩尽板内液体。（5）每孔加入 150（11 anti human tnf-ahrp,轻轻混匀 10s, 37 度孵

35、育 30min。（6）洗 板：各孔加入350卩1洗涤液，反复洗涤5次，每次甩尽板内液体。（7）每孔加入 100卩1显色液，轻轻混匀10s,置暗处室温孵育20mino每孔加入100（11终止液，轻轻混匀30s, 15min内用酶标仪在450nm处测定其od 值。（9）以od值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，并在曲线上计算出各个 样本的tnfa浓度值。6统计学方法统计分析采用spss 16.0软件，实验数据以均数土标准差（土 s ）表示。配对 的计量资料采用t检验进行分析，p<0.05被认为具有统计学意义。经方差齐性检验 （levene法）后，多个样本均数间的多重比较采用单因素方

36、差分析（one-way analysis of variance, one-way anova）中的 snk-q检验和 lsd-t 检验（方差齐性） 与tamhane法（方差不齐）。相关性检验采用线性回归分析。1 一般资料map组28例、sap组25例和正常对照组20例，三组之间年龄和性别构成、发 病原因等差异无统计学意义。表1研究对象各组基本资料组别例数男性/女性年龄（岁）control2013/758.3±7.6map2818/1056.9±7.8sap2516/955.9+10.8p0.5320.712表2本组ap发病病因（单位：例）胆源性酒精性咼脂血症性特发性map

37、17641sap165312各组并发症sap组发生sirs 9例（9/25 ）,死亡1例（1/25）,死亡原因为多器官功能衰竭 （multiple organ failure , mof）。map 组无并发症。3 pbmc中nf-kb表达的动态变化按照上述方法检测ap患者及正常对照组的nf-kbo分入院后第1天、第5天、 第10天3个时段对结果进行统计学分析。其中正常对照组的nfkb平均水平为19.1 ±8.4%o 第 1 天 map 组 nf-kb 平均水平为 32.9+9.6%, sap 组为 41.6+12.4%； 第5天map组nfkb平均水平为30.9+8.8%, sap组

38、为55.5+14.1%；第10天map组nfkb平均水平为23.7±9.1%, sap组为29.6±11.3%（如表3,图1）。结果显示， map组的nfkb在起病第1天就明显升高到最高峰，第5天较前下降，第10天恢 复正常。sap组的nfkb在起病第1天明显升高，第5天升至最高，第10天下降。 第5天sap组的nfkb高于map组，差异有统计学意义（pv0.05）。表3 nf-kb动态检测结果（单位：%）第1天第5天第10天control19.1±8.419.1±8.419.1±8.4map32.9+9.6a30.9+8.8a23.7

39、7;9.1sap41.6±12.4a55.5±14.1a*29.6±11.3注：表示与同日对照组比较,ap<0.05o 为sap组与同日的map组相比较,p<0.05ocontrolmapsap图1 pbmcs中nfkb水平4血清炎症因子浓度变化4.1 tnf-a按照上述方法检测ap患者及正常对照组的tnf-ao分入院后第1天、第5天、 第10天3个时段对结果进行统计学分析。其中正常对照组的tnf-a平均水平为30.5 ±8.5pg/ml o 第 1 天 map 组 tnf-a 平均 水平为 51.8±15.5pg/ml, sap

40、组为 54.8±15.6pg/ml；第 5 天 map 组 tnf-a 平均水平为 41.3±12.9pg/ml, sap 组为 77.4±17.2pg/ml；第 10 天 map 组 tnf-a 平均水平为 31.3±10.9pg/ml, sap 组为35.3±13.2pg/ml （如表4,图2）。结果显示，map组的tnf-a在起病第1天就明显升 高到最高峰，第5天较前下降，第10天恢复正常。sap组的tnf-a在起病第1天明 显升高，第5天升至最高，第10天下降。第5天sap组的tnf-a高于map组，差 异有统计学意义（pvo.05）

41、o表4 tnf-a动态检测结果（单位：pg/ml）人阮弟5大弟10大control30.5 ±8.530.5 ±8.530.5 ±8.5map51.8il5.5a41.3il2.9a31.3+10.9sap-54.8±15.6a77.4±17.2a_35.3±1327土： 衣小thj 口“ 畑俎 ix牧，*川殂t hj n hj mar殂比日比取(至u)d) aizhp<0.05ocontrolmapsap4.2 il6按照上述方法检测ap患者及正常对照组的il-6o分入院后第1天、第5天、第 10天3个时段对结果进行统计学分析

42、。其中正常对照组的il6平均水平为 26.6±8.0pg/ml。第 1 天 map 组 il6 平均水平为 64.0 ±12.5pg/ml, sap 组为 65.9±14.0pg/ml；第 5 天 map 组 il6 平均水平为 39.9±8.9pg/ml, sap 组为 89.5±13.4pg/ml；第 10 天 map 组 il-6 平均水平为 28.6 ±8.8pg/ml, sap 组为 38.9±16.3pg/ml （如表5,图3）。结果显示，map组的il6在起病第1天就明显升高 到最高峰，第5天较前下降，第10天

43、恢复正常。sap组的il-6在起病第1天明显升 高，第5天升至最高，第10天下降。第5天sap组的il6高于map组，差异有统计学意义（pvo.05） o表5il-6动态检测结果（单位：pg/ml）人阮弟5大弟10大control26.6+8.026.6+8.026.6±8.0map64.0+12.5a39.9+8.9a28.6±8.8sap65.9+14.0a89.5±13.4a* 38-9+16.3tt： g 衣小 t 冋口爼 ix杈，aaru.udo*川 dar冋 i_i uj iviar 爼”日兀书p<0.05ocontrolmapsap图3血清il

44、-6水平4.3 il-8按照上述方法检测ap患者及止常对照组的il-8o分入院后第1天、第5天、第 10天3个时段对结果进行统计学分析。其中正常对照组的il-8平均水平为 23.0±7.4pg/mlo 第 1 天 map 组 il-8 平均水平为 39.7±7.82pg/ml, sap 组为 51.2±12.0pg/ml；第 5 天 map 组 il8 平均水平为 35.2±8.2pg/ml, sap 组为 60.6±12.5pg/ml；第 10 天 map 组 il8 平均水平 为 27.3 士&5pg/ml, sap 组为 37.3

45、±12.1pg/ml （如表6,图3）。结果显示，map组的il8在起病第1天就明显升高 到最高峰，第5天较前下降，第10天恢复正常。sap组的il8在起病第1天明显升 高，第5天升至最高，第10天下降。第5天sap组的il8高于map组，差异有统 计学意义（pvo.05） o表6il8动态检测结果（单位：pg/ml）入院第5天第10天control23.0+7.423.0+7.423.0+7.4map39.7+7.8a35.2+8.2a27.3±8.5"sap51.2+12.0a60.6±12.5a37.3+12.1 a注： 厶表示厶同 口乂'

46、j照俎比较，zajku.ud。 为 bafillb 同 口的 majt 俎相比较,p<0.05ocontrolmapsap4.4 il-10浓度检测按照上述方法检测ap患者及正常对照组的il-10o分入院后第1天、第5天、 第10天3个吋段对结果进行统计学分析。其中正常对照组的il10平均水平为 33.7±10.5pg/mlo 第 1 天 map 组 il-10 平均水平为 42.5±13.3pg/ml, sap 组为 45.2±12pg/ml；第 5 天 map 组 ilj0 平均水平为 39.7±11.1 pg/ml, sap 组为 52.9&

47、#177;12.8pg/ml；第0 天 map 组 il-10 平均水平为 34.44±10.7pg/ml, sap 组为 63.2±13.4pg/ml （如表7,图4）。结果显示，map组的il10在起病第1天、第5天、 第10天较正常对照组相比均无统计学差异。sap组的il10在起病第1天明显升高, 第10天升至最高。第5天及第10天sap组的il-10高于map组，差异有统计学意 义（pvo.05） o表7 il-10动态检测结果（单位：pg/ml）入院第5天第10天control33.7+10.533.7+10.533.7+10.5map42.5+13.339.7+

48、11.134.44+10.7sap45.2±12a52.9±12.8a*63.2±13.4a*注：表示与同fi对照组比较，pv0.05。为sap组耳同h的map组相比较,p<0.05o3 control图4血清ilj0水平5相关性分析ap屮tnf-a. il-6> il8、il-10与nf-kb z间是否存在直接相关性，目前均 处于推测阶段，缺乏强有力的临床数据支持以及统计学分析。鉴于此，我们将sap 患者的细胞因子分别与nf-kb相关性进行统计学分析，从而为后期研究做进一步 指导和铺垫。5.1 nf-kb与tnf-a的相关性分析对sap患者的nf-k

49、b和tnf-a进行和关性统计学分析，结果显示r2=0.14, p=0013（p<0.05）,具有统计学差异。sap患者的nf+b与tnf-a呈线性关系，具有相关 性。结果如图5。图5 nf-kb与tnf（i相关性分析5.2 nf-kb与il-6的相关性分析对sap患者的nf-kb和il6进行相关性统计学分析，结果显示r=0.16,p 二 0.024（p<0.05）,具有统计学差界。nfkb与il6呈线性关系，具有相关性。如图6。图6 nf-kb与il6相关性分析5.3 nf-kb与il-8的相关性分析对sap患者的nfkb和il8进行相关性统计学分析，结果显示/=018, p=0.

50、027（p<0.05）,具有统计学差异。nfkb与il8呈线性关系，具有相关性。如图7。图7 nf-kb与il-8相关性分析5.4 nf-kb与il-10的相关性分析对sap患者的nfkb和il10进行相关性统计学分析，研究结果显示，r=o.28,p=0.34 (p>0.05), il-10与nfkb之间并无明显的统计学关联。00 0.000.250.500.751.00nf-kbp=0.34=0.28图8 nf-kb与il-10相关性分析迄今为止，ap的发病机制尚未完全阐明，目前认为是胰腺微循环障碍、蛋白酶、 磷脂酶a2及炎症细胞因子的激活等多种因素共同作用的结果】。在ap发生过

51、程 中，多种致病因素如微小结石、胆固醇结晶或胆泥阻塞胰管或胆胰管共同通道引发胰 腺腺泡细胞损伤，释放多种炎症细胞因子，导致胰腺及胰外脏器的损害，严重时可引 起mof和sirs 331 o nf-kb作为一种重要的核转录因子，可以调控多种炎性细胞因子的基因转录，使炎性细胞因子同时产生、高度表达并相互作用，构成ap复杂的细 胞因子网络本研究观察了 ap患者nfkb和相关细胞因子的变化趋势，并对nf-kb与细胞因子进行相关性分析，从而说明nf-kb及相关细胞因子在ap中的作用o1 nf-kb 与 ap大量动物实验中发现，多种ap动物模型均可诱导早期nfkb的活化，以及 随病程发展胰腺及胰外脏器中nf

52、-kb的活化均相应增加，提示nfkb活化可能在ap 的发病中发挥核心的作用【。sap时促炎因子如tnf(x、il6、il8等早期被激活 【，各种细胞因子之间通过级联反应，激活更多的炎性介质，如血小板激活因子 (platelet activating factor , paf)、前列腺素、一氧化氮(nitric oxide ,no)、白三烯、 缓激肽、组胺、氧白由基和氮氧化合物®等，从而导致生理紊乱，加重细胞损伤。 各促炎因子的表达升高，可能共同促进炎症的发展，在ap早期促使疾病向sap发展。 sap时【泗高浓度的tnf-a在sap由局部病变发展到全身性病损过程中起着主要作用, 其 水

53、平与sap预后正相关。aoun e等在sap患者il6、il-8的meta分析皿】中得出, il6、il-8水平升高，在一定程度上能预测sap的发生。本研究中sap组发生sirs 9例(9/25), map组无并发症，sap组比map组 预后 差。map、sap患者nf-kb. tnf-a> il-6. il-8水平早期明显升高，sap第 5天升高 最明显，与map组相比差异均有统计学意义(pvo.05) o提示了 nfkb、 tnf-a. il6、il-8水平高低与病情预后有相关性。我们的实验中还发现，sap中促炎因子tnf-a. il-6、il8均与nfkb具有明 显的正相关性。在a

54、p早期，促炎因子tnf-ail-6、il8即明显升高，与pereda j址-強和相关细胞因子在急性胰腺炎中作用的临床硏亦f- k b和相关细胞因了在急性胰腺炎屮作用的临桥研総 的研究结果一致391 o il-6介导急性期反应，il8参与嗜中性粒细胞趋化、激活和脱 颗粒。这些促炎因子正反馈放大炎症反应，通过激活蛋白激酶(mapks)和nfkb (371、诱导趋化因子和其他细胞因子释放从而导致sirso nf-kb活化的经典1型通路 即为促炎细胞因子引发模式，这些细胞因子如tnf-ot、il-k il-6激活ikb激酶复 合体(ikk),使ikb磷酸化并降解，nf-kb与ikb解离后活化【。有研究

55、表明】, nf-kb在ap发病机制中起重要的作用，nfkb作为核转录因子可以调控多种促炎细 胞因子如tnfa、il1、il-6、il-8的基因转录。伴随nfkb的活化，上述促炎细 胞因子都明显升高。所以，在ap中，nfkb可通过转录调控促炎因子，在ap的病 程屮发挥重要的作用。而促炎因子又增强nfkb活化，两者呈正反馈作用，最终促 进ap病情的进展。但本实验map组nfkb及tnf-a> il-6、il-8变化曲线不明显。 这需要我们进一步增加病例数、增加监测时间点，在今后的试验屮进一步探讨。2抑制nf-kb活化与ap的转归前文已经述及，作为细胞内一重要的转录因子，nfkb的激活在ap的

56、发生发展 中起极其重要的作用。对nfkb的早期抑制，明显影响着ap的转归。近年来大量文 献表明，早期阻断nfkb活化同样可以有效减少sap的致死率。目前研究认为活性 氧(ros)是引起nfkb激活的主要中介分子，细胞内、外源性刺激通过氧自由基增加、 激活第二信号转导系统，从而激活nfkb。抗氧化剂是活性nfkb的高效抑制剂。 在cck、牛磺胆酸盐或腆胆管结扎诱导ap的实验中，抗氧化剂n乙酰半胱氨酸 (nac)、雷索司特(raxofelast)> ntt咯烷二硫代氨基甲g(pdtc)421等均可抑制nfkb 活化及减少炎性细胞因子的产牛cpdtc预处理的动物nfkb的活化呈现剂量相关性 减

57、少,可明显提高大鼠的存活率。cox-2抑制剂、丙酮酸乙酯、抗生素也被证明能有 效抑制胰腺nf-kb的活化胁。yangr等研究发现，抗生素组可减少胰腺中ikb的 表达，其nfkb活化明显减少441o钙蛋白酶i抑制剂也能显著降低ap中nfkb活 化，机理可能是硫醇蛋白酶能促进ikb(x退化皿】。letohat等最近研究461 t一个新 型的细胞渗透性nfkb抑制剂抑制肽(pn50),可阻止nfkb活化。即使注入大 剂量cck, pn50仍能有效地降低ap的严重程度。同样,ceyhan go等】报导，预 防性甘氨酸治疗可早期阻断nfkb的活化，减少ap的严重程度。据龙锦等【網】报导,奥曲肽可抑制sa

58、p大鼠nfkb的活化，并通过抑制nfkb的活化抑制诱导型一氧化 氮合酶(inos)的表达，改善大鼠sap。上述研究均强有力的证明nfkb抑制剂能降低ap的严重程度，提高sap的生存 率。临床中药物的使用(如奥曲肽、抗生素等)对nfkb的抑制作用可能是影响ap 转归的重要因素。抑制nfkb的活化或能成为的ap治疗的新靶点。然而，由于nf kb抑制剂在细胞特异性、受其他信号分子的影响、具有潜在毒性等方面仍有许多不确 定性，其使用仍受到很大限制。3 il-10 与 ap在本实验中，sap组患者病程中不仅表现为促炎细胞因子tnfa、il6、il-8 的升高，同时也伴有抗炎细胞因子il10水平的升高。sap组中il10水平在起病 第