基因工程的基本工具和基本操作程序复习进程

1、基因工程的基本工具和基本操作程序ppt高频考点突破高频考点突破考点一考点一 基因工程的概念理解和理论基础基因工程的概念理解和理论基础1.1.基因工程的概念理解基因工程的概念理解 (1)(1)操作环境：体外操作环境：体外关键步骤关键步骤“表达载体的构表达载体的构 建建”的环境。的环境。 提醒提醒 切割的化学键为磷酸二酯键。切割的化学键为磷酸二酯键。 在 切 割 目 的 基 因 和 载 体 时 要 求 用 同 一 种 限 制 酶在 切 割 目 的 基 因 和 载 体 时 要 求 用 同 一 种 限 制 酶 , , 目的是产生相同的黏性末端。目的是产生相同的黏性末端。 将一个基因从将一个基因从DNA

2、DNA分子上切割下来分子上切割下来, ,产生两个切口产生两个切口, ,同时形成同时形成四个粘性末端四个粘性末端, ,切割载体产生一个切口，形成两个粘性末端。切割载体产生一个切口，形成两个粘性末端。 不 同不 同 D N AD N A 分 子 用 同 一 种 限 制 酶 切 割 产 生 的 黏 性 末分 子 用 同 一 种 限 制 酶 切 割 产 生 的 黏 性 末 端 都 相 同端 都 相 同 , , 同 一 个同 一 个 D N AD N A 分 子 用 不 同 的 限 制 酶 产 生 的分 子 用 不 同 的 限 制 酶 产 生 的 黏性末端不相同。黏性末端不相同。2.DNA2.DNA连接

3、酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”常用类型常用类型E Ecoli coli DNADNA连接连接酶酶T T4 4 DNADNA连接酶连接酶来源来源大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体功能功能连接黏性末端连接黏性末端连接黏性末端或连接黏性末端或平末端平末端结果结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键的磷酸二酯键 拓展提升拓展提升 DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的比较聚合酶的比较DNA DNA 连接酶连接酶DNA DNA 聚合酶聚合酶作用实质作用实质都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键酯键是否需模板是

4、否需模板不需要不需要需要需要连接连接DNADNA链链双链双链单链单链作用过程作用过程在两个在两个DNADNA片段之片段之间形成磷酸二酯键间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的存在的核酸片段的33端的羟基上端的羟基上, ,形成磷酸形成磷酸二酯键二酯键作用结果作用结果将两个将两个 DNADNA片段连片段连接成重组接成重组 DNADNA分子分子合成新的合成新的DNADNA分子分子3.3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车” (1)(1)类型类型 提醒提醒 质粒本质是质粒本质是DNA,DNA,不是细胞器不是细胞器; ;特点特点: :小小 型

5、环状。型环状。 (2)(2)功能：将目的基因导入受体细胞。功能：将目的基因导入受体细胞。 (3)(3)应具备条件应具备条件 能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；能在宿主细胞内稳定保存并大量复制； 有一个至多个限制酶的切割位点有一个至多个限制酶的切割位点, ,以便于与外源以便于与外源 基因连接；基因连接； 有特殊的遗传标记基因有特殊的遗传标记基因, ,供重组供重组DNADNA的检测和鉴定。的检测和鉴定。最常用载体最常用载体:质粒质粒其他载体其他载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒等噬菌体的衍生物、动植物病毒等 提醒提醒 一般来说一般来说, ,天然载体往往不能满足人类的天然载体往往不能满足人类的 所有要

6、求所有要求, ,因此人们根据不同的目的和需要因此人们根据不同的目的和需要, ,对某对某 些天然的载体进行人工改造。些天然的载体进行人工改造。 常见的标记基因有抗生素基因、产生特定颜色常见的标记基因有抗生素基因、产生特定颜色 的表达产物基因、发光基因等。的表达产物基因、发光基因等。 作为载体必须具有多个限制酶切点作为载体必须具有多个限制酶切点, ,而且每种酶而且每种酶 的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别 单一切点单一切点, ,若载体上有一个以上的酶切点若载体上有一个以上的酶切点, ,则切割则切割 重组后可能丢失某些片段重组后可能丢失某些片段, ,

7、若丢失的片段含复制起若丢失的片段含复制起 点区点区, ,则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载 体若只有某种限制酶的一个切点体若只有某种限制酶的一个切点, ,则酶切后既能把则酶切后既能把 环打开接纳外源环打开接纳外源DNADNA片段片段, ,又不会丢失自己的片段。又不会丢失自己的片段。 注意与细胞膜上载体的区别注意与细胞膜上载体的区别, ,两者的化学本质和两者的化学本质和 作用都不相同。作用都不相同。 质粒能自我复制质粒能自我复制, ,既可在自身细胞、受体细胞也既可在自身细胞、受体细胞也 可在体外复制。可在体外复制。考点三考点三 基因工程的基本操作程序基因

8、工程的基本操作程序1.1.基因工程图解基因工程图解: :抗虫棉的培育过程抗虫棉的培育过程二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序1目的基因的获取目的基因的获取(1)目的基因：指编码蛋白质的目的基因：指编码蛋白质的 。(2)获取目的基因的方法获取目的基因的方法从基因文库从基因文库 (基因组文库或基因组文库或cDNA文库文库)中获取中获取a基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多多 ，导入，导入 的群体中储存，各个受体菌分的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。结构基因结构基

9、因受体菌受体菌DNA片段片段文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小小小大大基因中启动子基因中启动子无无有有基因中内含子基因中内含子无无有有基因多少基因多少某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因物种之间的物种之间的基因交流基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以说明说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优优点点是操作简便是操作简便,缺点缺点是工作量大是工作量大,具有一定的具有一定的盲目性盲目性b.基因文库的种类基

10、因文库的种类c目的基因的获取依据：目的基因的获取依据：()基因的基因的 序列；序列；()基因的功能；基因的功能；()基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置；()基因的基因的 产物产物mRNA；()基因的翻译产物蛋白质。基因的翻译产物蛋白质。核苷酸核苷酸转录转录 人工合成目的基因人工合成目的基因: :常用的方法有化学合成法和常用的方法有化学合成法和 反转录法。反转录法。 化学合成法化学合成法: :蛋白质蛋白质 氨基酸序列氨基酸序列 RNARNA 碱基序列碱基序列 DNADNA碱基序列碱基序列 用用4 4种脱氧核种脱氧核 苷酸人工合成目的基因苷酸人工合成目的基因 反转录法反转录法: :分离出供

11、体细胞分离出供体细胞mRNA mRNA 单链单链DNADNA 合成目的基因合成目的基因 分析分析推测推测推测推测逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因aPCR的含义：是一项在生物体外的含义：是一项在生物体外 特定特定DNA片段的核酸合成技术。片段的核酸合成技术。b目的：获取大量的目的基因目的：获取大量的目的基因c原理：原理：DNA复制复制d前提条件：有一段已知目的基因的前提条件：有一段已知目的基因的 和根据该序列合成的和根据该序列合成的 e过程：目的基因受热形成过程：目的基因受热形成 ，与引物，与引物结合，在结合，在 的作用下延伸形成的作用下延伸

12、形成DNA。f方式：指数扩增方式：指数扩增2n(n为扩增循环的次数为扩增循环的次数)复制复制核苷酸序列核苷酸序列单链单链DNADNA聚合酶聚合酶引物PCRPCR扩增技术与扩增技术与DNADNA复制的比较复制的比较PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点点原理原理DNADNA复制复制( (碱基互补配对碱基互补配对) )原料原料四种游离的脱氧核苷酸四种游离的脱氧核苷酸条件条件模板、模板、ATPATP、酶、原料、引物、酶、原料、引物不不同同点点解旋解旋方式方式DNADNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化场所场所体外复制体外复制(PCR(PCR扩增仪扩增仪) )主要在细胞

13、核内主要在细胞核内酶酶热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶) ) 细胞内含有的细胞内含有的DNADNA聚合酶聚合酶结果结果在短时间内形成大量的在短时间内形成大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子基因表达载体的构建基因表达载体的构建最核心步骤最核心步骤（）表达载体的功能（）表达载体的功能使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 给下给下一代。一代。使目的基因使目的基因 和发挥作用。和发挥作用。（）基因表达载体的组成（）基因表达载体的组成: :启动子目的基因终止子启动子目的基因终止子标记基因。标记基因。遗传遗传表达表达

14、启动子：位于基因的启动子：位于基因的 ，它是，它是 识识别和结合的部位，驱动基因转录产生别和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。终止子：位于基因的尾端，终止终止子：位于基因的尾端，终止 。标记基因：标记基因： 是否含有目的基因。是否含有目的基因。 （）基因表达载体的构建方法（）基因表达载体的构建方法 提醒提醒 该过程把三种工具该过程把三种工具( (只有两种工具酶只有两种工具酶) )全用全用 上了上了, ,是最核心、最关键的一步是最核心、最关键的一步, ,在体外进行。在体外进行。mRNA的转录的转录鉴别受体细胞鉴别受体细胞首端首端RNA聚合酶聚合酶3将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞

15、转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并在受体转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持细胞内维持 的过程。的过程。(1)将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞方法：方法：农杆菌转化法农杆菌转化法a农杆菌特点：易感染农杆菌特点：易感染 植物和裸子植物，植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力；对大多数单子叶植物没有感染能力；Ti质粒的质粒的 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。上。 b转化过程：转化过程：将目的基因插入将目的基因插入转入农杆菌转入农杆菌导入植物细胞导入植物细胞整合到受体细胞的整合到受体细胞的DNAD

16、NA上。上。基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法双子叶双子叶TDNATiTi质粒的质粒的T TDNADNA上上稳定和表达稳定和表达(2)将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法：方法： 注射技术。注射技术。操作程序：操作程序：将含有目的基因的表达载体提纯将含有目的基因的表达载体提纯取卵取卵获得获得显微注射显微注射早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植发育成为具有新性状的动物发育成为具有新性状的动物。(3)将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞微生物作为受体细胞特点：个体微小，代谢旺微生物作为受体细胞特点：个体微小，代谢旺盛，盛， ，获得目的基因产物多。，获得目的基因产物

17、多。转化：转化： 处理细胞处理细胞重重组表达载体分子与感受态细胞混合组表达载体分子与感受态细胞混合促进感受促进感受态细胞吸收态细胞吸收DNA分子。分子。提醒提醒 唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。显微显微用用Ca2繁殖速度快繁殖速度快受精卵受精卵感受态细胞感受态细胞 (4)(4)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定解题思路探究解题思路探究思维误区警示思维误区警示易错分析易错分析 基因工程中易错点辨析不清基因工程中易错点辨析不清 (1)(1)基因工程中有基因工程中有3 3种工具种工具, ,但工具酶只有但工具酶只有2 2种。种。 (2)(2)工具酶本质为蛋

18、白质工具酶本质为蛋白质, ,载体本质为小型载体本质为小型DNADNA分分子子, ,但不一定是环状。但不一定是环状。 (3)(3)标记基因的作用标记基因的作用筛选、检测目的基因是筛选、检测目的基因是否导入受体细胞否导入受体细胞, ,常见的有抗生素抗性基因、发光基常见的有抗生素抗性基因、发光基因因, ,表达产物为带颜色物质等。表达产物为带颜色物质等。 (4) (4)受体细胞中常用植物受精卵或体细胞受体细胞中常用植物受精卵或体细胞( (经组织经组织培养培养) )、动物受精卵、动物受精卵( (一般不用体细胞一般不用体细胞) )、微生物、微生物大肠杆菌、酵母菌等大肠杆菌、酵母菌等, ,但要合成糖蛋白、有生物活性但要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必需用真核生物酵母菌的胰岛素则必需用真核生物酵母菌需内质网、高需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体尔基体的加工、分泌。一般不用支原体, ,原因是它营原因是它营寄生生活寄生生活; ;一定不能用哺乳动物成熟红细胞一定不能用哺乳动物成熟红细胞, ,原因是它原因是它无细胞核无细胞核, ,不能合成蛋白质。不能合成蛋白质。1、许多人企求着生活的完美结局，殊不知美根本不在结局，而在于追求的过程。2、慢慢的才知道：坚持未必就是胜利，放弃未必就是