第2章酶制剂的生产

1、LOGO酶技术与应用课程酶技术与应用课程第第2章章 酶制剂的生产酶制剂的生产江南大学生物工程学院江南大学生物工程学院2012年年2月月山东青岛山东青岛LOGO主要内容2.1 国内外酶制剂工业生产及应用现状2.2 酶的发酵技术2.3 酶的分离纯化2.4 酶的剂型与保存LOGO2.1国内外酶制剂工业生产及应用现状国内外酶制剂工业生产及应用现状LOGO2.1.1新技术在生产中的应用三种方法： 组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶 微生物发酵：最大量的来源 化学及生物合成：生物重组高新技术的应用：酶的修饰、固定化、基因重组、膜分离技术、冷冻干燥LOGO2.1.2. 集中垄断，市场全球化：v规模企业由20世

2、纪80年代初的80多家减少至20多家，占市场90%v丹麦诺维信novozymes1978年进入中国（天津）；v美国杰能科公司（Genencor）98年进入中国，与无锡合资，控股80%（无锡，2005年杰能科国际公司被丹尼斯克公司收购）；LOGO2.1.3. 品种、规模不断扩大v 目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域。v 我国2000年酶制剂产量为30万吨，100家，市场份额仅占5%，以未经除菌去渣的粗制品粉状酶为主。v 国际以液体、颗粒为主。v 国内糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶三大类占了97%v 我国有7家上市公司介入酶制剂开发生产。LOGO2.1.4. 应用领域不断扩大：v 美国酶制

3、剂年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲料工业、洗涤剂工业、化学工业。LOGO2.2 酶的发酵技术酶的发酵技术LOGO2.2 酶的发酵技术利用微生物产酶的优点是：(1) 微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。(2) 微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。(3) 微生物培养基来源广泛、价格便宜。(4) 可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。(5) 可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。LOGO2.2.1 产酶微生物v菌种是发酵生产酶的重要条件

4、。v菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关系密切。v已经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有5060种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。LOGO第二章第二章 酶的发酵生产酶的发酵生产酶源v酶可由动物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物（如木瓜蛋白酶）和微生物（细菌、霉菌、酵母）产生，其中工业酶制剂大多数由微生物发酵法生产。v由于微生物世代时间短，繁殖快、容易培养和管理，可大规模工业化生产，所以工业酶制剂大多由微生物发酵产生。LOGO产酶微生物的获得（1）从有关菌种保藏机构购买）从有关菌种保藏机构购买v 如中国科学院微生物研究所如中国科学

5、院微生物研究所CGMCCCGMCC，日本大阪发酵研究所，日本大阪发酵研究所IFOIFOv ATCC (American Type Culture Collection)ATCC (American Type Culture Collection)v DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) Cultures)v JCM (Japan Collection of Microorganisms)JCM (Japan C

6、ollection of Microorganisms)v VKM (All-Russian Collection of Microorganisms)VKM (All-Russian Collection of Microorganisms)LOGO产酶微生物的获得产酶微生物的获得v CBS (Centraalbureau voor SchimmelculturesCBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures荷兰真菌中荷兰真菌中 心收藏所心收藏所) )v UKNCC (United Kingdom National Culture Collection)

7、UKNCC (United Kingdom National Culture Collection)v NCIMB (National Collections of Industrial, food NCIMB (National Collections of Industrial, food and Marine Bacteria) and Marine Bacteria)LOGO（2） 从自然界中分离筛选从自然界中分离筛选v 从与产生目的酶菌种可能相适应的生态环境中，采样分离从与产生目的酶菌种可能相适应的生态环境中，采样分离筛选。筛选。1克土壤中含有克土壤中含有1108个微生物，自然界蕴藏

8、着巨个微生物，自然界蕴藏着巨大的微生物资源。同时重视微生物资源、基因文库、基因大的微生物资源。同时重视微生物资源、基因文库、基因表达载体等方面的建设，以及极端环境微生物，不可分离表达载体等方面的建设，以及极端环境微生物，不可分离微生物，绝对厌氧微生物等新的种质资源的研究开发。微生物，绝对厌氧微生物等新的种质资源的研究开发。LOGO从极端环境微生物和不可培养微生物筛选新酶种v 嗜热微生物（嗜热微生物（Thermophiles 60-85 ， 超嗜热菌生长温度超嗜热菌生长温度85以上以上,105 ）。）。v 嗜冷微生物（嗜冷微生物（Psychrophiles -100 ）v 嗜盐微生物嗜盐微生物(

9、Halophiles, 含盐含盐32%或或5.2%)v 嗜酸微生物嗜酸微生物(Acidophiles,pH2.5)v 嗜碱微生物嗜碱微生物(Alkalophiles, pH 11)v 嗜压微生物嗜压微生物(Barophiles，1.01105KPa, 4 107KPa)LOGO不可培养微生物v用PCR技术从土样中直接扩增DNA，能够从不可培养的微生物中分离到DNA，并用作克隆来源，可获得更多种类的酶。LOGO链霉菌（链霉菌（Streptomyces）v 链霉菌是一种放线菌。菌落呈放射状，有分枝菌丝体，菌链霉菌是一种放线菌。菌落呈放射状，有分枝菌丝体，菌丝直径丝直径0.2-1.2m，G+。v 菌

10、丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，气生菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，气生菌丝形成孢子链。菌丝形成孢子链。v 可产生葡萄糖异构酶，纤维素酶，碱性蛋白酶，中性蛋白可产生葡萄糖异构酶，纤维素酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，几丁质酶，青霉素酰化酶等。酶，几丁质酶，青霉素酰化酶等。LOGO放线菌的形态 放线菌的菌落LOGO霉菌霉菌v 黑曲霉（黑曲霉（Aspergillus niger）v 米曲霉（米曲霉（Aspergillus oryzae）v 青霉（青霉（Penicillium）v 木霉（木霉（Trichoderma）v 根霉（根霉（Rhizopus）v 毛霉（毛霉（Mucor）

11、v 红曲霉（红曲霉（Monascus）LOGO根霉的形态根霉的形态 各种曲霉的菌落各种曲霉的菌落LOGO细菌v 大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）v 芽孢杆菌（芽孢杆菌（Bacillus）v 枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）蛋白酶）蛋白酶v 地衣芽孢杆菌（地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）高温）高温-淀粉酶淀粉酶LOGO杆菌 红弧菌杆菌杆菌 红弧菌红弧菌LOGO酵母菌酵母菌v 啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可产丙酮酸脱羧酶，醇）可产丙酮酸脱羧酶，醇脱氢酶等。脱氢酶等。LOGO

12、酵母的形态酵母的形态 红酵母的菌落红酵母的菌落LOGO产酶微生物的分离筛选方法产酶微生物的分离筛选方法（1） 平板分离（选择性分离筛选平板）平板分离（选择性分离筛选平板）（2） 摇瓶逐个检测方法摇瓶逐个检测方法 培养基培养基v 细菌：营养肉汤琼脂培养基（细菌：营养肉汤琼脂培养基（pH 7.0，30-37）v 霉菌：可用察氏、土豆（霉菌：可用察氏、土豆（PDA）、麦汁琼脂培养基）、麦汁琼脂培养基（pH5.5， 2520，为了防止霉菌菌落蔓延连成一片，可，为了防止霉菌菌落蔓延连成一片，可加入加入0.1%去氧胆酸钠、去氧胆酸钠、0.1%山梨糖等限制菌落扩散）山梨糖等限制菌落扩散）v 放线菌：高氏培养

13、基、甘油精氨酸培养基等，放线菌：高氏培养基、甘油精氨酸培养基等，pH6.87.0LOGO 酵母：用麦汁琼脂培养基（pH4.55.5）v 为了提高菌种分离效率，分离培养基中可添加一定数量的为了提高菌种分离效率，分离培养基中可添加一定数量的药剂以抑制干扰微生物的生长。药剂以抑制干扰微生物的生长。v 如为了抑制霉菌的生长，可加入如为了抑制霉菌的生长，可加入3050U/ml 制霉菌素、克念制霉菌素、克念霉素、杀霉素等多烯类抗生素，不妨碍细菌的生长繁殖。霉素、杀霉素等多烯类抗生素，不妨碍细菌的生长繁殖。v 为了抑制细菌的生长，可添加青霉素（为了抑制细菌的生长，可添加青霉素（30U/ml）、四环素、）、四

14、环素、猛加拉红（猛加拉红（0.001%），不干扰霉菌的生长。），不干扰霉菌的生长。v 为了抑制酵母的生长，可添加放线菌酮（为了抑制酵母的生长，可添加放线菌酮（50mg/ml），不影），不影响细菌的生长。响细菌的生长。选择性培养基选择性培养基LOGO选择性培养基选择性培养基v 用酸性或碱性培养基，可分离耐酸、耐碱微生物；用酸性或碱性培养基，可分离耐酸、耐碱微生物；v 用添加了高浓度食盐培养基，可分离耐盐微生物；用添加了高浓度食盐培养基，可分离耐盐微生物；v 用添加了高浓度盐或蔗糖的培养基，可分离耐高渗透压的用添加了高浓度盐或蔗糖的培养基，可分离耐高渗透压的微生物；微生物；v 在高温下培养，可筛选

15、耐热、耐高温微生物，在高温下培养，可筛选耐热、耐高温微生物，v 分离芽孢杆菌，可先将样品于分离芽孢杆菌，可先将样品于80加热加热10-15min，可杀死，可杀死不产芽孢微生物后，再进行分离。不产芽孢微生物后，再进行分离。LOGO 为了提高工作效率，可设计一些肉眼可检测的方法，为了提高工作效率，可设计一些肉眼可检测的方法，如水解透明圈、变色圈等方法，鉴别出产酶菌落。如水解透明圈、变色圈等方法，鉴别出产酶菌落。 LOGO 酶酶 培养基中的底物培养基中的底物 检检 测测 方方 法法 v -淀粉酶 0.1%0.5%可溶性淀粉 平板浇注稀碘液，可在 兰色背景显示出明亮的水解圈v 蛋白酶 干酪素 透明圈v

16、 果胶酶 果胶 平板浇注1%溴化十六烷基三甲 铵，未水解的果胶沉淀而形成白 色背景产生果胶酶的菌落周围出 现透明的水解圈v 乳糖酶 向长菌落的平板培养基上喷洒邻硝 基苯-D-半乳糖（ONPG），由于 乳糖酶可分解ONPG 而游离出黄色 邻硝基苯，检出产酶菌。v 普鲁兰酶 0.3%普鲁兰糖 培养后浇注乙醇，产酶菌株可 产生水解圈v 纤维素酶 0.5%磷酸膨化纤维 产酶菌落周围形成水解圈LOGOv免疫学检测方法 酶联免疫荧光测定技术， 96孔LOGO2.2.2 酶的发酵技术v2.2.2.1 培养基 培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。LO

17、GO（1）碳源l碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。l当前酶制剂生产上使用的菌种大都只利用有机碳有机碳的异养型微生物。l有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品中1216碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。LOGO 不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。 另外，选择碳源除考虑营养要求外，还要考虑酶生物合成的诱导作用和是否存在分解代谢物阻遏作用。

18、尽量选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。 例如，淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。LOGO（2）氮源 氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。 酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮源两种，常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。LOGO 不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。 一般来说，动物细胞要求有机氮，植物

19、细胞主要要求无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果。 例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加1%3%的无机氮源。LOGO（3） 碳氮比 在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的不同而改变的。 一般蛋白酶 (包括酸性、中性和碱性蛋白酶) 生产采用碳氮比低的培养基比较有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生产采用由豆饼粉3.75 %、玉米粉0.625%、鱼粉0.625%。NH4Cl 1%、CaCl2 0.5%、Na2HP0

20、4 0.2%、豆饼石灰水解液10%组成的培养基； LOGO 淀粉酶(包括淀粉酶、糖化酶、淀粉酶等)生产的碳氮比一般比蛋白酶生产略高，例如枯草杆菌TUD127淀粉酶生产采用由豆饼粉4 %、玉米粉8 %、Na2HP04 0.8%、 (NH4)2SO4 0.4%、CaCl2 0.2%组成的培养基。而在淀粉酶生产中糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的。 以上是蛋白酶和淀粉酶生产培养基碳氮比的一般规律，但是由于菌种很多而其性质各异。很难说都是符合上述规律的。LOGO（4） 无机盐 微生物酶生产和其他微生物产品生产一样，培养基中需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。 在酶生产中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾

21、等磷酸盐作为磷源，以硫酸镁为硫源和镁源。 钙离子对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有十分重要的稳定作用，例如在无Ca2+存在时灰色链霉菌中性蛋白酶只在pH77.5很小范围内稳定，当有Ca2+存在时稳定pH范围可以扩大到57。LOGO（4） 无机盐 钠离子有控制细胞渗透压使酶产量增加的作用，酶生产的培养基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式加入，例如米曲霉淀粉酶生产，添加适量的硝酸钠以促进酶生产。 在天然培养基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉为碳源时，添加100 ppm Co2+和Zn2+，放线菌166蛋白酶活力可增加70%80%。LOGO（5）生长因子 微生物还需一

22、些微量的像维生素一类的物质，才能正常生长发育，这类物质统称生长因子(或生长素)。 其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。酶制剂生产中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。玉米浆中一般含有生长素32128mg / mL。LOGO（6） 产酶促进剂 产酶促进剂是指在培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。 产酶促进剂大体上分为两种：一是诱导物，二是表面一是诱导物，二是表面活性剂。活性剂。表面活性剂，如吐温80的浓度为0.1 %时能增加许多酶的产量。表面活性剂能增加细胞的通透性，处在气液界面改善了氧的传递速度，还可以保

23、护酶的活性。LOGO（6） 产酶促进剂 生产上常采用非离子型表面活性剂，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、羧甲基纤维素、苯乙醇等。离子型的表面活性剂对微生物有害。用于食品、医药的酶的生产中所用的表面活性剂还须对人、畜无害。此外各种产酶促进剂的效果还受到菌种，种龄、培养基组成的影响。LOGO培养基优化培养基优化v单因子试验单因子试验v正交实验正交实验vPlackett-Burman试验试验v 最陡爬坡试验最陡爬坡试验v 响应面分析试验响应面分析试验 LOGO发酵罐结构示意图发酵罐结构示意图LOGO2.2.2.3 液体深层发酵的工艺控制酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶性能的影响外，还

24、受酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶性能的影响外，还受到发酵温度、到发酵温度、pH、溶氧量等条件的影响。、溶氧量等条件的影响。v (1) 温度对产酶的影响温度对产酶的影响 发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度的变化而变化的。拌速度的变化而变化的。 微生物在生长发育中，不断地吸收培养基营养成分来合成菌微生物在生长发育中，不断地吸收培养基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都是吸热反应；培养基中的体的细胞物质和酶时的生化反应都是吸热反应；培养基中的营养物质被大量分解时的生化反应都是放热反应。营养物质被大量分解时的

25、生化反应都是放热反应。LOGO2.2.2.3 液体深层发酵的工艺控制 发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量，发发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量，发酵液需要升温。当菌体繁殖旺盛时，情况则相反，发酵液温酵液需要升温。当菌体繁殖旺盛时，情况则相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，这时，发酵液度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，这时，发酵液必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需的适宜温度。必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需的适宜温度。LOGO 微生物生长繁殖和产酶的最适温度随着菌种和酶的性质不同而异，生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。 一般细菌

26、为37 ，霉菌和放线菌为2830 ，一些嗜热微生物需在4050 下生长繁殖，如红曲霉生长温度3537，而生产糖化酶的最适温度为3740 。 在酶生产中，为了有利于菌体生长和酶的合成，也有进行变温生产的。LOGO 例如以枯草杆菌ASl.398进行中性蛋白酶生产时，培养温度必须从31 逐渐升温至40 ，然后再降温到31进行培养，蛋白酶产量比不升温者高66%。 据报道，酶生产的温度对酶活力的稳定性有影响，例如用嗜热芽孢杆菌进行淀粉酶生产时，在55 培养所产生的酶的稳定性比35 好。LOGO(2) pH对产酶的影响 种子培养基和发酵培养基的pH直接影响酶的产量和质量。 在发酵过程中，微生物不断分解和同

27、化营养物质，同时排出代谢产物。由于这些产物都与pH有直接关系，因此发酵液pH在不断发生变化。 生产上根据pH的变化情况常作为生产控制的根据。 一般来说，培养基成分中碳/氮(C/N)比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N低，发酵液倾向于碱性，pH高。LOGO(2) pH对产酶的影响 pH的这些变化情况，常常引起细胞生长和产酶环境的变化，对产酶带来不利的影响。 因此生产中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加缓冲液维持一定的pH；调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；调节培养基的初始pH，保持一定的C / N比；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。LOGO(3) 通

28、风量对产酶的影响 其实通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。 一般来说，在发酵初期，虽然幼细胞呼吸强度大，耗氧多，但由于菌体少，相对通风量可以少些；菌体生长繁殖旺盛期时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛时的通风量因菌种和酶种而异，一般需要强烈通风；但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。 因此，菌种、酶种、培养时期、培养基和设备性能都能影响通风量，从而影响酶的产量。 目前用于酶制剂生产的微生物都为好气性微生物，生产上普遍采用自动测定和记录溶解氧的仪表。LOGO调节溶解氧的方法调节溶解氧的方法v 调节通风量，通风量是指单位时间内流经培养液的空调节通风量，通风量是指单位时间内流经培养液的空 气量

29、，一般常用培养液体积与每分钟通入的空气体积气量，一般常用培养液体积与每分钟通入的空气体积 之比来表示（之比来表示（vvm），如），如1m3培养液，每分钟通入的培养液，每分钟通入的 空气量为空气量为0.6m3,则通气量为则通气量为1：0.6。v 调节气液接触时间，气液两相接触时间延长，氧气有调节气液接触时间，气液两相接触时间延长，氧气有 更多的时间溶解在培养基中，通过增加液层高度（发更多的时间溶解在培养基中，通过增加液层高度（发 酵高径比加大），降低气流速度，罐中增设档板等方酵高径比加大），降低气流速度，罐中增设档板等方 法。法。LOGOv 调节气液接触面积，溶氧是通过气液界面进行的，提高调节气

30、液接触面积，溶氧是通过气液界面进行的，提高 气液两相接触面积，有利提高溶解氧。减少气泡体积，气液两相接触面积，有利提高溶解氧。减少气泡体积， 发酵罐底部安装空气分配管，装设搅拌装置或增加挡板，发酵罐底部安装空气分配管，装设搅拌装置或增加挡板， 可使气泡进一步打碎，延长气液接触时间。可使气泡进一步打碎，延长气液接触时间。v 提高氧的分压。增加罐压，或提高空气中氧的含量，都提高氧的分压。增加罐压，或提高空气中氧的含量，都 能提高氧的分压，从而提高溶氧速率。能提高氧的分压，从而提高溶氧速率。v 改变培养液的性质，培养液粘度大，导致改变培养液的性质，培养液粘度大，导致Kla降低，同降低，同 时易产生泡

31、沫，可以加入无菌水降低发酵液粘度。时易产生泡沫，可以加入无菌水降低发酵液粘度。 一般控制溶氧速率等于或稍高于耗氧速率即可。一般控制溶一般控制溶氧速率等于或稍高于耗氧速率即可。一般控制溶氧饱和度氧饱和度DO在在20%左右。全自动发酵罐，可通过调节转速左右。全自动发酵罐，可通过调节转速或通风量来控制溶氧。或通风量来控制溶氧。LOGO(4) 搅拌的影响 对于好气性微生物的深层发酵，除了需要通气外，还需要搅拌。 搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。 但搅拌速度主要因菌体大

32、小而异，由于搅拌产生剪切力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵液温度发生变化。 搅拌速度还与发酵液黏度有关。LOGO(5) 泡沫的影响 发酵中往往产生较多的泡沫。 泡沫的存在阻碍了二氧化碳的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影响补料，也易使发酵液溢出罐外造成跑料。因此，生产上必须采用消泡措施。 一般除了机械消泡外，还可利用消泡剂。消泡剂主要是一些天然的矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。 我国常用聚氧丙烯甘油醚或泡敌(聚环氧丙环氧乙烷甘油醚)。理想的消泡剂，其表面相互作用力应低，而且应难溶于水，还不能影响氧的传递

33、速率和微生物的正常代谢。LOGO泡沫控制方法泡沫控制方法v 调整培养基成分，如不加或缓加易起泡的原料，或改变调整培养基成分，如不加或缓加易起泡的原料，或改变pH、温度、通风、罐压和搅拌，或采用分次投料来控制。、温度、通风、罐压和搅拌，或采用分次投料来控制。v 采用机械消泡装置，用消泡浆打碎泡沫，或把泡沫引出罐采用机械消泡装置，用消泡浆打碎泡沫，或把泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或利用离心力来消除泡沫。外，通过喷嘴的加速作用或利用离心力来消除泡沫。v 添加消泡剂，外界加入消泡剂使泡沫破碎的方法，主要是添加消泡剂，外界加入消泡剂使泡沫破碎的方法，主要是具有降低表面张力的表面活性剂。具有降低表面张

34、力的表面活性剂。LOGO发酵方式发酵方式v 固体发酵：固体发酵反应器有转鼓（桶）式、转（盘）固体发酵：固体发酵反应器有转鼓（桶）式、转（盘）轴式、浅盘式。一般来说固体发酵产酶活力是液体发酵酶轴式、浅盘式。一般来说固体发酵产酶活力是液体发酵酶活力的几十到几百倍。活力的几十到几百倍。v 液体发酵：机械搅拌发酵罐，气升环流发酵罐。可实现液体发酵：机械搅拌发酵罐，气升环流发酵罐。可实现在线控制在线控制pH、溶氧、搅拌转速、温度等工艺参数。、溶氧、搅拌转速、温度等工艺参数。LOGO液体发酵的几种方式液体发酵的几种方式v 分批（间歇）发酵（分批（间歇）发酵（Batch culture）：所有的基质和营养）

35、：所有的基质和营养物质一开始就加入，培养容易。物质一开始就加入，培养容易。v 连续发酵（连续发酵（Continuous culture）：底物不断加入，产物）：底物不断加入，产物不断移走，可在最高酶合成速率和最适菌体浓度下进行，不断移走，可在最高酶合成速率和最适菌体浓度下进行，具有生产率高的特点，但酶浓度比流加发酵低，在操作过具有生产率高的特点，但酶浓度比流加发酵低，在操作过程中容易发生染菌及菌种退化问题。程中容易发生染菌及菌种退化问题。v 流加发酵（流加发酵（Fed-batch culture，FBC）：营养物质连续或）：营养物质连续或半连续加入，流出物非连续移走或不移走。半连续加入，流出物

36、非连续移走或不移走。 LOGO流加发酵的优点流加发酵的优点v 可避免高浓度底物对菌体生长的抑制，以及底物分解成大量可避免高浓度底物对菌体生长的抑制，以及底物分解成大量产物后所产生的分解代谢阻遏抑制产酶，可使残留的底物浓产物后所产生的分解代谢阻遏抑制产酶，可使残留的底物浓度维持在低浓度水平。度维持在低浓度水平。v 可避免培养基中某些成分在高浓度时对细胞的毒害作用。可避免培养基中某些成分在高浓度时对细胞的毒害作用。v 可获得很大的菌体量（生物量），较好的生产率及产量，可可获得很大的菌体量（生物量），较好的生产率及产量，可提高单位体积发酵液的酶产量。提高单位体积发酵液的酶产量。v 可以使发酵过程最佳

37、化，使菌种保持在最大生产力的状态，可以使发酵过程最佳化，使菌种保持在最大生产力的状态，实现酶的高产，并可大大降低下游过程中酶的分离或提取的实现酶的高产，并可大大降低下游过程中酶的分离或提取的成本。成本。LOGO流加控制策略流加控制策略v pHv 溶氧溶氧v 尾气分析尾气分析v 底物浓度底物浓度v 比生长速率比生长速率LOGO 发酵生产酶制剂用无菌空气的标准发酵生产酶制剂用无菌空气的标准v 空气中的微生物一般都依附于尘埃粒子和雾滴上，空气中的微生物一般都依附于尘埃粒子和雾滴上， 空空气中的尘埃粒子和雾滴的大小一般在气中的尘埃粒子和雾滴的大小一般在110m，v 细菌中的球菌直径为细菌中的球菌直径为

38、0.52m，v 杆菌的长度杆菌的长度 15m，宽度，宽度 0.51mv 弧菌的长度弧菌的长度 15m，宽度为，宽度为0.31m 所以，空气中只要能除去所以，空气中只要能除去0.3m以下的微粒，以下的微粒， 就可认为是无菌空气。就可认为是无菌空气。LOGO空气预处理流程空气预处理流程v 在沿海潮湿地区，特别是夏季，空气中湿含量较大，应采在沿海潮湿地区，特别是夏季，空气中湿含量较大，应采取将压缩空气先冷却到露点以下，析出部分水分，然后再取将压缩空气先冷却到露点以下，析出部分水分，然后再升温使相对湿度下降升温使相对湿度下降60%以下，进空气过滤器。一般采用以下，进空气过滤器。一般采用二级冷却析水加热

39、空气的预处理流程。二级冷却析水加热空气的预处理流程。v 大气大气粗过滤粗过滤空气压缩机空气压缩机贮罐贮罐一级冷却器一级冷却器旋风分旋风分离器离器二级冷却二级冷却丝网除沫器丝网除沫器加热器加热器总过滤器总过滤器分过分过滤器滤器发酵罐发酵罐LOGO固体发酵罐固体发酵罐 LOGO液体发酵罐结构示意图液体发酵罐结构示意图 LOGO液体发酵罐液体发酵罐 LOGO 30升全自动发酵罐升全自动发酵罐LOGO30升全自动发酵罐升全自动发酵罐LOGO工业发酵罐工业发酵罐LOGO现代发酵的发展趋势现代发酵的发展趋势v清液发酵清液发酵v流加发酵（浓醪发酵、细胞高密度培养）流加发酵（浓醪发酵、细胞高密度培养）v连续灭

40、菌连续灭菌v发酵与产物分离偶合发酵与产物分离偶合LOGO酶制剂的发酵生产过程图解酶制剂的发酵生产过程图解LOGO2.3 酶的分离纯化酶的分离纯化l酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。l酶的纯化过程，就目前而言，还是一门实验科学。l一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，没有通用的规律可循。l酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是特定的一种酶在细胞中的含量很少，二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。LOGO基本概念v 酶活力(Enzyme activity)：酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量。v 1961年国际酶学会规定，l min催化lmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位 ( 国际单位 ) ，温度为25 ，其它条件 (pH、离子强度) 采用最适条件。LOGOv 酶的总活力为样品的全部酶活力。 总活力 = 酶活力 总体积 (mL) 或 = 酶活力 总质量 (g)LOGOv 比活力比活力 (Specific activity) ：比活力是指单位蛋白质 (毫克蛋白质或毫克蛋白氮) 所含有的酶活力 (单位/毫克蛋白) 。v 比活力是酶纯度指标，