分子生物学实验溶血素基因的克隆与序列

1、分子生物学实验 实验一 PCR（聚合酶链反应）基因扩增实验原理PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原

2、料，引物沿53方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。1模板DNA的变性模板DNA加热到9095时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板

3、DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97，时间适当延长，即所谓的热启动。2模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至3765时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为12min。3引物的延伸DNA

4、模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为4060个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需24min，一次PCR经过3040次循环，约23h。扩增初期，扩增的量呈直线

5、上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y（1X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产

6、物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段

7、3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。变性延伸退火图 PCR的反应历程PCR反应体系 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模

8、板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。设计引物应遵循以下原则： 引物长度： PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为15-30bp，常用的是1827bp，但不应大于38bp。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板

9、很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：引物的G+C含量以4060%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。引物中四种

10、碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。避免引物内部出现二级结构。引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3末端形成的二聚体，应控制其G大于-5.0 kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3端或近3端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量

11、避免3末端有发卡结构的引物。引物3'端的碱基。引物3末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。引物3末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。引物3末端的稳定性由引物3末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的G。G值是指DNA双链形成

12、所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩增有较大的影响。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），负值大，则3末端稳定性高，扩增效率更高。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。需要注意的是，如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。引物的5端。引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、

13、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形

14、成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。此酶具有以下特点：（1）耐高温，在70下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95下反应2小时后为原来的40%。（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb，且特异性也较高。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR

15、扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用

16、SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中

17、，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可

18、合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓

19、度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在

20、7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DN*段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCR反应特点（1） 特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反

21、应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。（2）灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检

22、出率为3个细菌。 （3）简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。（4）对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。PCR扩增产物的分析PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不

23、同的分析方法。凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳： 通常应用12%的琼脂糖凝胶， 供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变

24、的有效方法。Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。实验二 凝胶电泳电泳基本原理电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电

25、场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动在一定的电场强度下，DNA分子的迁

26、移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系质粒DNA分子有三种构型，即CCCDNA、OCDNA和LDNA，这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，CCCDNA泳动最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNAEB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测1

27、0ng 的DNA注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套影响DAN片段琼脂糖电泳的几个因素： 1、DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子 量的对数值成反比。 2、琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。 3、DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。 4、电流强度：每

28、厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。5、碱基组成与温度：一般影响不大4 -30  6、嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中) 7、电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。琼脂糖凝胶浓度的选择1.核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 在

29、凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成正比。2、琼脂糖凝胶电泳分离NDA是，分子大小不宜超过20kb3.不同大小的DNA需要不同浓度的琼脂凝胶进行电泳分离琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb 560 120 0.810 0.57 0.46 0.24 0.13实验三 DNA片段回收纯化AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至 8 g DNA（70bp-10Kb），回收率为 60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A 溶液)中熔化，其中的保护剂能防止线状 DNA在

30、高温下降解，然后在DE-B溶液的作用下使 DNA 选择性结合到膜上。纯化的DNA纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR扩增、测序、微注射等分子生物学实验。Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含 DNA 保护剂，防止 DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。 Buffer DE-B：结合液（促使大于 70bp 的 DNA 片段选择性结合到 DNA 制备膜上）。室温密闭贮存。 Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。 Buffer W2 concentrate：去盐液，使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（用 100%乙醇或 95% 乙醇），混合均匀，室温密闭贮存

31、。 Eluent：洗脱液，室温密闭贮存。操作步骤 1. 在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提 前记录 1.5 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg=100 l 体积）。 2. 加入 3个凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75°C加热（低熔点琼脂糖凝胶于 40°C加热），间 断混合（每 2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约 6-8 min）。【* Buffer DE-A为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。】3. 加 0.5个Buffer DE-A 体积

32、的 Buffer DE-B，混合均匀。当分离的 DNA 片段小于 400bp 时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。【* 加Buffer DE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。】步骤 4-6可以选择负压法或离心法。 A. 负压法 4A. 正确连接负压装置，将 DNA 制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤 3 中的混合液，转移到 制备管中，开启并调节负压至-25-30 英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。 5A. 加 500 l Buffer W1，吸尽管中溶液。 6A. 加 700 l Buffer W2，吸尽管中溶液。【* 确认在Buffer W2 concentrate中已按

33、试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。】 【* 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。】 7A. 将制备管置于 2 ml离心管（试剂盒提供）中，12,000×g离心 1 min。 B. 离心法 4B. 吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g 离心 1 min。弃滤液。 5B. 将制备管置回2 ml离心管，加500 l Buffer W1，12,000×g 离心30 s，弃滤液。 6B. 将制备管置回2 ml离心管，加700 l Buffer W2，12,000×g离

34、心30 s，弃滤液。【* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。】【* 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。】 7B. 将制备管置回 2 ml离心管中，12,000×g离心 1 min。 8. 将制备管置于洁净的 1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加 25-30 l Eluent 或去离子水，室温静置 1 min。12,000×g离心 1 min 洗脱 DNA。【* 将Eluent或去离子水加热至65将提高洗脱效率。】常见问题分析 回收率低1. 目的片段结合量低 1) 琼

35、脂糖凝胶未完全熔化时目的片段只有部分结合到膜上，导致其余的片段在后续洗涤过程中丢失以及出现制备管堵塞现象，最终影响回收效率。在切胶时尽可能去除不含目的片段的琼脂糖，确保buffer DE-A的正确用量。在熔胶过程中要仔细检查确保无固体琼脂糖残留，间隔性的对样品进行摇晃促进凝胶的充分熔化。 2) 小于400bp 的片段未加异丙醇务必确保已加入1倍凝胶体积的异丙醇（100%）。 3) 电泳缓冲液 pH值过高，影响目的片段的结合，建议加入10l 3M NaAC中和。 2. 结合的DNA片段过早的被洗脱，Buffer W2中未加无水乙醇或者乙醇浓度不是95 - 100%的 确保加入正确的乙醇量。每次使

36、用后应拧紧瓶盖，以免乙醇挥发，降低回收率。 3. 洗脱效率低 ，最后一次Buffer W2洗涤完后不要将制备管放于负压 装置上抽得过干。 洗脱液或者去离子水65°C预热以及增加洗脱前静置时间至5min，都可提高洗脱效率。选用合适浓度的琼脂糖凝胶电泳，上样量不超过制备管的最大结合量（8g）。 乙醇沉淀DNA步骤 1. 加入1/10体积的乙酸钠（3 mol/L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3 mol/L； 2. 加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20中1530分钟； 3.&#

37、160;12,000 g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴； 4. 加入1/2离心管容量的70乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴； 5. 于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干； 6. 加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。如何有效提高凝胶纯化pcr产物的效率1 用好的柱子（也就是买好公司的回收盒），或用玻璃奶（对于大片段感觉损失比较小）2 切胶时间短，用长波；3 溶完胶后凉一下再上柱，高温不易使DNA与柱结合；4 可以二次上柱5 将洗脱缓冲液预先65度加热，大

38、片段洗脱时最好放几分钟再离心；6 可以二次洗脱。DNA重组（连接反应）DNA重组：在DNA连接酶的作用下,在含有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接,获得重组DNA分子。实验步骤将插入片段与载体片段按 >3:1的比例添加 载体 2µl (100ng) 目的片段(0.7kb) ?µl (100ng) 6µl 10XT4 ligase buffer 1µl T4连接酶 2µl ddH2O 补齐到总体积10µl 反应总体积 10µl混合于EP管(标记)中且混匀,Short离心实

39、验四 感受态的细胞制备 CaCl2诱导法感受态及转化实验原理转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。在0的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的

40、部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 1、从新活化的E.coli DH5平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培养中，37振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600，至OD600为0.30.4时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； n  3、培养物于冰上放置20min； 4、 04，5500g离

41、心10min，弃去上清液，加入100ul冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞,冰浴30分钟； 5、 04，5500g离心10min，弃去上清液，加入100 µL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4放置1224h，其转化效率可以增高46倍；也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。影响转化效率的因素细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产

42、生感受态OD值：0.30.5 (5X107个/ml)试剂的质量：化合物及无机离子：Rb+、Mn+、二甲亚砜等质粒：大小、构型外源DNA（质粒）与细胞的比例：器皿的洁净度污染尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行质粒的转化1、100µl的感受态细胞分成2管(50µl/EP管)2、实验样品: 将5µl质粒DNA加入到50µl感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打)（标记P+）3、阴性对照：将2µl无菌水加入到50µl感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打)（标记P-）4、冰浴30min（热击）42，90sec，静置，勿摇动，迅速

43、放到冰上,冰浴25min（复苏）加入950µl LB液体培养基（无抗性），标明组号，37，涂布实验五 质粒的提取重组转化子的筛选抗生素筛选法： 菌株为某种抗性缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素（Ampr）抗性基因编码一种周质酶（-内酰胺酶）可特异地切割Amp的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力。 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。互补法：又称蓝白斑筛选法，质粒上LacZ基因编码的肽链与受体菌中编码的半乳糖苷酶C端突变体互补，形成有功能的半乳糖苷酶，在特定培养基上显蓝斑，这种现象称为互补。如果有外源DNA片段插入质粒上的LacZ基因中，则半乳糖苷酶失活，显白斑。载

44、 体定义：基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。类型：大肠杆菌中的质粒、l噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒载体等。载体的基本条件复制子：一段具有特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制。可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反应。限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基因的插入。适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。质粒载体: 是染色体外小型的双链环状的DNA，常用载体之一;自我复制;具有合适的限制酶切位点;筛选标记可编码某些遗传性状 如抗药性、耐受重金属、产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外的

45、特性;高拷贝数;小分子量1-200Kb;高稳定性.质粒提取的常用方法碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同）苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布）CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同）SDS 裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清）玻璃纤维膜法(试剂盒)碱裂解法提取质粒DNA实验原理 根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性

46、迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。碱法提取质粒主要试剂是三种溶液，一般称溶液I，溶液，溶液。它们的组成见下：溶液I：50retoolL葡萄糖，25retoolL Tris（三羟甲基氨基甲烷）·HCI【由于Tris缓冲液为弱碱性溶液，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性。人们常常在Tris盐酸缓冲液中加入EDTA制成“TE缓冲液”，TE缓冲液被用于DNA的稳定和储存。如果将调节pH值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE缓冲液”（Tris/Acet

47、ate/EDTA），而换成硼酸则获得“TBE缓冲液”（Tris/Borate/EDTA）。这两种缓冲液通常用于核酸电泳实验中】，lOmmolL EDTA，pH值80；溶液：02molL Na0H，lSDS（十二烷基硫酸钠）【SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸：蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。】；溶液：3molL醋酸钾，2molL醋酸。溶液l的主要作用是悬浮细菌菌体，使菌体悬浮均匀，不能有结块，否则影响质粒提取。溶液中的

48、葡萄糖使溶液密度增加，可以减缓大肠杆菌沉积到管底部的速度；此外，在溶液裂解细胞时，葡萄糖溶液可以避免菌体破裂后，产生的压力变化造成细菌DNA被剪切力打断，影响提取质粒的纯度。但实际应用时，我们发现溶液I中不加葡萄糖对质粒提取影响不大，葡萄糖需要与否是可选择的。EDTA是Ca“和Mg“等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase（脱氧核糖核酸酶）【是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶】的活性。溶液的作用主要是破坏细菌，使质粒从细胞内释放。其中02molL的NaOH是主要的细胞裂解试剂，NaOH可以使细胞膜破坏，同时伴随蛋白质和核酸变性。变性的蛋白质空

49、间结构被破坏，形成无规则的多肽链；DNA的氢键被打断，但是由于大肠杆菌的基因组DNA和质粒DNA均是双链闭环DNA分子，所以无论基因组DNA，还是质粒DNA的两条DNA链都不会游离成单链的DNA分子。大肠杆菌基因组DNA较长，可以与多肽链相互缠绕，相对分子量小得多的质粒不易与多肽链缠绕。1十二烷基硫酸钠(SDS)的主要功能不是破坏细胞，而是分散缠绕的多肽链，与多肽链形成SDS一多肽复合体，使变性蛋白质溶解在溶液中，使多肽链更好地与基因组DNA缠绕。注意，一些教材中认为变性DNA沉淀是错误的，不管是变性的DNA，还是双链DNA分子均溶解在水中。溶液的主要作用是沉淀变性的蛋白质和基因组DNA。加入

50、溶液后会有大量的沉淀。什么原因造成大量的沉淀呢?一些教材认为是醋酸中和碱，使变性蛋白质沉淀；还有些教材认为加入溶液后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了。这些解释都是错误的，变性的蛋白质可以很好地溶解在1一2的SDS溶液中(做过SDSPAGE电泳就知道，蛋白质是用SDS溶液溶解的)；至于DNA，无论是变形的DNA，还是复性的DNA，DNA分子在中性溶液中都能溶解。实际上造成变形蛋白质大量沉淀的主要原因不是醋酸，而是十二烷基硫酸钾。十二烷基硫酸钾中的钾离子是醋酸钾带入的，钾离子置换了十二烷基硫酸钠中钠离子，生成十二烷基硫酸钾沉淀。由于十二烷基硫酸盐与变形蛋白质结合成复合体，十二烷基硫酸钾的沉淀就将

51、变形的蛋白质沉淀，同时变性的蛋白质与基因组DNA缠绕，结果也大部分被沉淀了而高离子浓度的溶液又加速了这一沉淀过程；此外，溶液中和后变形蛋白质表面电荷减少，也可以促进变形蛋白质沉淀。如果将醋酸钾换成等量的醋酸钠是否也有同样的结果呢？我们实验发现，这样处理可以出现少量的沉淀，这是溶液中和及溶液离子强度增加造成的少量变性蛋白质沉淀，醋酸钠代替醋酸甲处理获得的质粒含有大量的蛋白质和基因组的NDA。实验步骤1、细菌培养和收集将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。（已完成）取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中, 10000rpm离心1min，吸去培养

52、液。2、细菌裂解及质粒的提取将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。加200ul溶液II(新鲜配制),盖紧管盖,轻轻混匀内容物,将离心管放冰上5min。加150ul溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠倒数次使混匀。冰上放置5min。12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。3、质粒的纯化向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿(1:1) （注意下层是有机相）,反复混匀。12000rpm,离心2分钟,将上清小心地转移到另一离心管（标记！）中加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇 (24:1),反复混匀。12000rpm,离心2分钟，取上清液于新的EP管中。4

53、、质粒的浓缩加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后,室温放置10min。12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀, 振荡并离心, 12000rpm离心2分钟，倒去上清液, 空气中干燥510min。5、质粒的溶解和保存加20ul TE缓冲液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。-20保存。6、质粒DNA的电泳检测（1）琼脂糖凝胶的制备每4人制备一块琼脂糖凝胶（6个泳道）0.2克琼脂糖+20毫升TAE缓冲液，电炉融胶（充分溶解），稍微冷却加2µlgoldviewna显示液，倒在电泳胶槽中，使胶

54、凝固(20min)。（2）琼脂糖凝胶电泳每人1个样品，pET28a或pEGFP-N3。取3µl质粒DNA+1.0µl点样缓冲液，在parafilm膜上混匀后全部点至琼脂糖凝胶孔（记住自己点样位置）。接通电泳仪和电泳槽的电源(注意正负极)（-+）恒压150V,电泳10-20分钟紫外灯下观察并记录结果(对面实验室拍照片)分析结果。讨论核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质，再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。使用苯酚抽提细胞 DNA 时，苯酚的作用是使蛋白质变性，同时抑制了 DNase 的降解

55、作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。 （酚易溶于氯仿中） 异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡 产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。在TE缓冲液中为什么要加入EDTA？TE为含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)缓冲液：其中比较关键的成分是EDTA，日常环境中不可避免的存在DN

56、ase，而DNase的活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金属离子，从而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。实验六 质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测限制性内切酶类型 I型 II型 III型特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。多数限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸，呈二

57、元对称，少数识别更长的序列，有的切割后形成平端，有的形成粘端。酶单位定义：在指明pH与37，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1µg的DNA的酶量为1单位。 酶反应条件：缓冲体系（多酶切原则） 酶切温度 反应时间 DNA的纯度和浓度。加样顺序：水+缓冲液+DNA+酶。影响限制性内切酶的因素：DNA制品中的污染（蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS)解决办法：增加酶反应体积以稀释可能的抑制剂增加酶作用单位(过多的甘油抑制酶活性)延长反应时间 （1-16小时）部分酶切和完全酶切 （克隆常用手段） 酶的保存 -20无菌ddH2O 7 l 5xbuffer K 2 l 10xBSA 2 l 质粒DNA 5 l BamHI 2 l NotI 2 l 总