病毒载体概述实用教案

1、病毒(bngd)载体概述（1）要求：要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2、介导外源基因转移、介导外源基因转移(zhuny)和表达和表达 3、对机体不致病、对机体不致病容量容量(rngling)：自身基因组大小的：自身基因组大小的105%110% 类型：类型：1 1、重组型病毒载体 2 2、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型 可复制型 复制缺陷型组成：1 1、病毒复制和包装元件 2 2、病毒基因 3 3、插入的外源基因或元件 4 4、病毒外壳/ /外膜 用途：基因转移和表达 1、基因治疗 2、疫苗 3、器官移植 4、组织工程 5、转基因动物 6、

2、基因功能研究 第1页/共15页第一页，共16页。病毒(bngd)载体概述（2）优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体(zit)具有不同的表达特点。存在的问题：存在的问题：1 1、安全性、安全性2 2、靶向性、靶向性3 3、有效性、有效性细胞毒性细胞毒性染色体毒性染色体毒性免疫毒性免疫毒性转导靶向性转导靶向性转录靶向性转录靶向性转导效率转导效率靶向性靶向性基因表达水平和持续时间基因表达水平和持续时间表达的可调控性表达的可调控性第2页/共15页第二页，共16页。病毒载体病毒载体生物学特性生物学特性适用范围适用范围反转录病毒载体反转录

3、病毒载体 单链单链 RNA 病毒病毒 810kb可感染分裂细胞；可感染分裂细胞；整合到染色体中；整合到染色体中；表达时间较长；表达时间较长；有致癌的危险；有致癌的危险；Ex vivo 基因治疗；基因治疗；肿瘤基因治疗。肿瘤基因治疗。腺病毒载体腺病毒载体 双链双链 DNA 病毒病毒 36kb可感染分裂和非分裂细胞；可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；外源基因表达水平高；表达时间较短；表达时间较短；免疫原性强；免疫原性强；In vivo 基因治疗；基因治疗；肿瘤基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗。疫苗。AAV 病毒载体病毒载体 单链单链 DNA 病毒病毒 5k

4、b可感染分裂和非分裂细胞；可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高；网膜等组织中表达较高；In vivo 基 因 治基 因 治疗；疗；Ex vivo 基因治疗；基因治疗；遗传病基因治疗；遗传病基因治疗；获得性慢性疾病的获得性慢性疾病的基因治疗。基因治疗。HSV 病毒载体病毒载体 双链双链 DNA 病毒病毒 152kb具有嗜神经性；可逆轴突传具有嗜神经性；可逆轴突传递；递；可潜伏感染；可潜伏感染；容量大；容量大；可感染分裂和非分裂

5、细胞；可感染分裂和非分裂细胞；神经系统疾病的基神经系统疾病的基因治疗；因治疗；肿瘤的基因治疗。肿瘤的基因治疗。常用(chn yn)的病毒载体的特点：第3页/共15页第三页，共16页。病毒载体(zit)研究方向1、病毒(bngd)包装系统 2、无病毒(bngd)基因的病毒(bngd)载体6、自我扩增型病毒载体7、条件增殖型病毒载体5、嵌合型病毒载体3、靶向性病毒载体4、可调控表达的病毒载体8、新病毒载体第4页/共15页第四页，共16页。病毒载体(zit)包装系统组成：1、宿主细胞 2、辅助元件(yunjin)（辅助质粒、辅助病毒） 3、被包装的DNA/RNA 包含顺式作用元件(yunjin) 单

6、因素(yn s)生产系统（one-component system)双因素生产系统 (two-component system) gag pol envLTRLTR 图1 反转录病毒包装系统示意图图2 腺病毒包装系统示意图 293 cellE1a,bJM17Ad Shuttle 293 cellE1a,b第5页/共15页第五页，共16页。多因素(yn s)生产系统 (multi-component system)多因素系统 双因素系统图3 腺病毒(bngd)伴随病毒(bngd)包装系统示意图host cellHelper virusHelper plasmidrep cap Vector pl

7、asmidHost cell +vector DNAHelper virus +helper plasmid图4 双因素(yn s)系统生产重组AAV病毒示意图proviral cellRecombinant helper virus(rHSV-repcap)rep cap 第6页/共15页第六页，共16页。无病毒(bngd)基因的病毒(bngd)载体被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病毒的外壳(wi k)/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。腺伴随病毒(bngd)载体：反转录病毒载体：腺病毒载体：单纯疱疹病毒载体：L

8、TRLTR genegeneITRITRpAgeneITRITRpAgenepacorigenegenegenegene第7页/共15页第七页，共16页。无辅助病毒(bngd)包装系统图5 重组AAV无辅毒包装(bozhung)系统adenovirusgeneITRITRaav vector plasmidE2a E4orf6 VA Helper plasmid:293细胞E1a,bcre293-cregeneITRITRAdenovirus with packaging signal flanked by loxP 图6 mini-adnovirus无辅毒包装(bozhung)系统第8页/共

9、15页第八页，共16页。靶向性病毒(bngd)载体转导(zhun do)靶向性转录(zhun l)靶向性（特异性）改造病毒外壳/外膜连接靶向性结合分子Modified adenoviruscell组织特异性启动子肿瘤选择性启动子细胞周期调控启动子肿瘤血管内皮导向启动子双特异性启动子病毒增殖的特异性转录调控第9页/共15页第九页，共16页。可调控表达的病毒(bngd)载体细胞的调控(dio kn)元件病毒的调控(dio kn)元件人工合成的调控元件细胞特异性转录细胞启动子 病毒启动子albumin MVM P4Tyrosinase or TRP-1 B19 promoterPSA HBVMBP

10、JCV MCK EBVGFAP NSE KDR/flt-1AFPCEAerbB2HREMDR1P1tTAtetOpgeneP1tTAtetOpgenetTAtetOpgenetetOp四环素调控合成的转录因子GAL4PRVP16RXREcRVP16FKB12ZFHD-1FRAPP65rapamycinRU486GAL4ERVP16ESTRADIOLGAL4ERp65Diphenol indenemuristerone第10页/共15页第十页，共16页。 自我扩增型载体自我扩增型载体（self-amplifying vector） ：） ：这类载体是以正链 RNA 病毒 Sindbis 病毒和

11、Semliki Forest 病毒为基础的。用目的基因代替病毒的外壳蛋白编码序列，导入靶细胞中，病毒的复制蛋白大量复制重组的基因组，mRNA 水平的大量增加导致高水平的转导基因表达。自我扩增型载体的表现形式可以是RNA，DNA 和重组病毒。 条件增殖型病毒载体条件增殖型病毒载体（conditionally replicating vector） ：） ： 指可在某种特性的组织中产毒性复制，而在其它组织中不增殖的病毒载体。这类病毒载体主要用于特异性裂解肿瘤细胞。如天然的腺病毒突变株 Onyx-015 是 55Kdal E1B 基因功能缺失的腺病毒突变株，可以选择性地在 p53 基因突变的肿瘤细胞

12、中增殖，而在正常组织细胞中不增殖。用这种突变株联合化疗治疗恶性肿瘤 II 期临床结果令人鼓舞（Kirn D et al. 1998） ，已进入 III 期临床试验，从此，许多人工改造的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研究中。 嵌合型病毒载体嵌合型病毒载体（hybrid viral vector） ：） ： 指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺病毒与 AAV 病毒的杂合体病毒，既具有腺病毒的感染性和基因组特性（双链线状 DNA） ，又具有 AAV 病毒的染色体整合性（Lieber A et al.1999） 。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷，如单纯疱疹病毒扩增子

13、与 AAV 病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997） 、腺病毒与 EB 病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等，不一而足。这些杂合载体使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。第11页/共15页第十一页，共16页。重组(zhn z)病毒的生产和纯化小量制备(zhbi)和纯化大量(dling)制备和纯化场所细胞培养细胞裂解病毒分离病毒纯化制剂保存培养瓶 转瓶、细胞工厂、发酵罐反复冻融 机械法或化学法裂解 实验室 中试车间 离心 离心、超滤、萃取密度梯度超速离心 浓缩、柱

14、层析配方缓冲液低温第12页/共15页第十二页，共16页。病毒(bngd)载体与基因治疗产业化基因治疗产品的知识产权(zh sh chn qun)构成 1、治疗基因2、调控元件3、改造的外壳/外膜4、靶向分子5、包装系统6、生产和纯化技术7、制剂和保存技术产业化的组织和实施： 1、合作开发2、专业分工3、政府支持(zhch)和企业投资4、利益分配基因治疗的三个核心部分 1、基因载体系统2、基因表达系统3、治疗基因第13页/共15页第十三页，共16页。知识产权(zh sh chn qun)和基础研究专利对学术研究的影响1、无影响（对非常(fichng)早期研究）2、有影响（对临床试验和可能的商业开发）基因治疗领域的知识产权主要通过(tnggu)专利系统来保护对于基因治疗公司最重要的专利是：1、载体系统； 2、生产过程；3、整体治疗方案 治疗基因和表达系统可以从其它方购买使用权。 政府支持对基因治疗产业化的重要作用1、政策上促进基因治疗的科研、临床和商业开发2、资助基因治疗核心技术研究和开发3、资助建立能规模化生产临床级基因载体的中心或基地4、支持从事基因治疗的公司发展新技术、新产品5、促进新的基因治疗公司建立。6、制定规范、高效且符合国情的审批程序。第14页/共15页第十四页，共16页。感谢您的观看(gunkn)！第15页/共15页第十五页，共16页。NoI