白血病免疫分型讲课最终本实用教案

1、 正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。 白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫(miny)分型。由于白血病细胞具有肿瘤细胞的特征，其抗原表达又不完全同于正常血细胞，常可出现某些抗原缺乏、过度表达、系列交叉表达某一系列或阶段不应有的抗原，这又增加了白血病免疫(miny)分型的复杂性。白血病/淋巴瘤的免疫(

2、miny)分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。第1页/共32页第一页，共33页。早 年 曾 用 过 的 荧 光 显 微 镜 或 A P A A P 方 法 基 本 被 废 弃 。 国 际 上 公 认 的 通 用 的 方 法 是 流 式 细 胞 术 （ F C M ） 。 流 式 细 胞 术 （ F C M ） 白 血 病 免 疫 分 型 是 利 用 荧 光 素 标 记 的单 克 隆 抗 体 （ M c A b ） 作 分 子 探 针 ， 多 参 数 分 析 白 血 病 细 胞 的 细 胞 膜 和 细 胞 浆 或 细 胞 核 的 免 疫 表 型 ， 由 此 了 解 被 测 白 血

3、病 细 胞 所 属 细 胞 系 列 及 其 分 化 程 度 。 因 为F C M 能 快 速 ， 多 参 数 ， 客 观 的 定 性 又 定 量 测 定 细 胞 膜 ， 浆 ， 核 的 抗 原 表 达 。另 一 个 重 要 理 由 是 至 今 尚 未 发 现 白 血 病 / 淋 巴 瘤 的 特 异 抗 原 。 所 以 能 用 正 常 血 细 胞 的 单 抗 来 进 行 免 疫 分 型 是 基 于 白 血 病 形 成 的 分 化 阻 断 学 说 即 白 血 病 细 胞 基 因 异 常 ，分 化 受 阻 于 某 阶 段 形 成 不 同 亚 型 的 白 血 病 。 这 群 细 胞 充 盈 于 骨 髓

4、 。 抗 原 表 达 与 其 相 应 系 列 / 阶 段 的 血 细 胞 无 明 显 差 异 。 与 形 态 学 检 查 ( j i n c h ) 相 似 仅 能 根 据 数 量 的差 异 来 判 断 病 变 细 胞 的 属 性 。第2页/共32页第二页，共33页。 单参数免疫标志测定易将正常细胞包括在内。因此，近年来主张用设门（gating）方法。即用CD45与侧向角（side scatter,SSC），对数取样后可将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞，单核细胞，成熟粒细胞，幼稚细胞和红细胞群，其理论依据是CD45是所有白细胞的抗原。其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（bl

5、asts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。SSC反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞SSC最高，依次为单核细胞，淋巴细胞，blasts，红细胞。以CD45/SSC双参数，对数取样时即可把各细胞群区分出来(ch li)。若同时加上一个，二个甚或三个荧光标记的单抗，则很容易识别非正常细胞群所表达的抗原。这样可以排除正常细胞的干扰。在幼稚细胞低的情况下或检测残存白血病时尤为必要 FCM分析白血病免疫表型时，测量细胞数量一般在1000050000细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研

6、究等有重要价值。 第3页/共32页第三页，共33页。 一 白细胞分化抗原 白细胞分化抗原（leukocyte differentiation antigen，LDA）指血细胞在分化成熟(chngsh)为不同谱系（lineage） 、分化的不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。 它们大都为跨膜分子，由胞外区、跨膜区和胞浆区组成；有些以糖基磷脂酰肌醇（GPI）“锚”在细胞膜上； 它们大都是蛋白或糖蛋白，少数为碳水化合物第4页/共32页第四页，共33页。 二 CD的概念、CD分子的分 类、功能(gngnng)及应用 CD：用以单克隆抗体鉴定为主的聚类分析法，将来自不同实验室的单克隆抗体

7、所识别的同一分化抗原归为一个分化群（Cluster of differentiation，CD）。并以此(y c)代替分化抗原以往的命名。 在许多情况下，单克隆抗体及其识别的相应抗原都用同一个CD序号。 迄今为止，人CD分子的序号已从CD1命名至CD371，可大致划分为14个组。第5页/共32页第五页，共33页。第6页/共32页第六页，共33页。 CD分子的功能： （1）免疫应答过程中参与免疫细胞的相互识别；免疫细胞识别抗原(kngyun)、活化、增殖和分化；免疫效应功能的发挥； （2）参与造血细胞的分化和造血过程的调控； （3）参与炎症的发生； （4）参与细胞的迁移如肿瘤细胞的转移等。第7页

8、/共32页第七页，共33页。 CD分子(fnz)的临床应用 CD单克隆抗体可用于 （1）阐明某些疾病的发病机制； （2）广泛应用于多种疾病的免疫诊断； （3）治疗移植排斥反应和肿瘤等疾病；第8页/共32页第八页，共33页。第9页/共32页第九页，共33页。第10页/共32页第十页，共33页。 CD20分子(fnz) 结构与分布：单链跨膜蛋白，仅表达于B细胞(xbo)， 早期即表达，分化为浆细胞(xbo)后消失 功能： （1）参与和调节B细胞(xbo)信号转导、生长和分化。 （2）直接参与调节跨膜Ca2+的流动。第11页/共32页第十一页，共33页。 三 免疫(miny)分型常用的免疫(miny

9、)标志及其意义 第12页/共32页第十二页，共33页。 白血病系列(xli)分化抗原 T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物(u yn hu w)酶）。 红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。 巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。 第13页/共32页第十三页，共33页。 白血病系列(xli)非特异性抗原 CD34、HLADR为早期细胞抗原(kngyun)，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞

10、CD34、HLADR、CD38，原始细胞CD34、HLADR、CD38，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34、HLADR、CD38。第14页/共32页第十四页，共33页。 白血病分化阶段(jidun)抗原 T细胞(xbo)抗原：CD4、CD8。 B细胞(xbo)抗原：CD10、Cy（胞浆链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg （胞浆免疫球蛋白）、CD11C。第15页/共32页第十五页，共33页。 白细胞共同(gngtng)抗原 CD45为白细胞共同抗原，但原幼细胞表达量比成熟淋巴细胞低，幼红细胞不表达。用SSC/CD45 PerCP双参数(cnsh)分析可十分容易鉴别骨髓和血液中

11、的原始或成熟细胞。用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，经FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五参数(cnsh)分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。第16页/共32页第十六页，共33页。 四 白血病免疫(miny)分型 急性( jxng)髓系细胞白血病第17页/共32页第十七页，共33页。 MO Mo blasts 有低的SSC和FSC。在CD45SSC图上出现在淋巴细胞位置上，至少表达(biod)一个特异性标志如CD13或CD116，但MPO比CD13与CD33更灵敏。一般淋系标志阴性，但也可表达(b

12、iod)CD7或CD4。 Mo blasts一般HLADR、CD34阳性，有些研究表明CD7与CD34共表达(biod)在AML且预后差。第18页/共32页第十八页，共33页。M 1 流 式 上 M 1 与 M 0 相 似 不 易 区 分 ， M 1 一 般 C D 1 3 、 C D 3 3 、 H L A D R ， 但 C D 3 4 表 达 少 于 M 0 ， 可 能 表 达 部 分 ( b f e n ) C D 1 5 。 M 2 M 2 与 M 1 要 区 别 是 成 熟 度 增 加 ， b l a s t s 减 少 ， C D 1 5 较 M 1 较 显 著 ， C D 3

13、4 弱 于 M 1 ， C D 1 3 有 时 表 达 强 于 C D 3 3 ， 多 数 病 例 H L A D R （ - ） 。 C D 4 5 S S C 图 显 示 从 髓 系 b l a s t区 至 成 熟 骨 髓 细 胞 区 的 连 续 细 胞 带 ， C D 4 5 S S C 图 有 助 于 确 定 b l a s t s 比 例 。第19页/共32页第十九页，共33页。 M3 高颗粒性，具较高的SSC，但CD45较成熟细胞少，多数情况(qngkung)HLADR（-）或表达减少，CD34少于M2、一般CD13弱（），可有CD2表达。第20页/共32页第二十页，共33页。

14、M4与M5 两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（），较之M0、M1，M4与M5有更大的FSS和SSC，CD45SSC图上，成熟C出现在单核区，重要(zhngyo)的表型为CD13、CD33、HLADR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13，CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能为M5，但只出现在少数病人中，部分M5可见CD56（）。第21页/共32页第二十一页，共33页。 M6 M6较少见且特征不明显，一般HLADR，CD34、CD13、CD33阳性(yngxng)，CD45SSC图显示主要为红系成份。 M7 巨核细胞白血病，在AML中少于1。一般CD61（Gpa）

15、和/或CD41（Gpb-a）阳性(yngxng)，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假阳性(yngxng)，可以用流式双色分析在EDTA存在下，测pb/a与CD34以减少激活血小板的粘附。第22页/共32页第二十二页，共33页。 急性(jxng)淋巴细胞白血病 ALL是儿童中最常见(chn jin)的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的25，在成人，ALL约占急性白血病的25，我们将ALL分为B祖细胞型，CD10或CD10，前B细胞型，B细胞型，T细胞型第23页/共32页第二十三页，共33页。 B祖细胞型ALL：在幼儿约占ALL的6570，青少年为5560，人为50。在儿童，约90病例CD10，在

16、幼儿只有少于50病例CD10，blasts一般FSC、SSC很少，是FAB标准的L1或L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分为2个亚型，CD10和CD10，前者预后好，多数(dush)病例CD24，CD34，CD20表达随成熟度增加而增加，B祖细胞被定义为sIg-。第24页/共32页第二十四页，共33页。 前B细胞型ALL：此亚型约占儿童ALL的25，细胞一般为CD19，CD24，HLADR，胞浆CD22，CD10，TdT随CD20变化，CD34多为阴性，前B亚型被认为比B祖型预后更差，这与t(1；19)出现相关并由此产生E2APBX1融合蛋白，它的表型为CD19、

17、CD10、CD9，不同(b tn)程度CD20表达，CD34，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。第25页/共32页第二十五页，共33页。 B细胞(xbo)型ALL：成熟B细胞(xbo)型ALL约占ALL25，B细胞(xbo)型ALL较之B祖细胞(xbo)型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45SSC图上出现在淋巴和单核细胞(xbo)区域，即FAB标准的L3，表型为CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多数为IGM）多数病例CD10。但成熟抗原及sIg使之区别于更早的B系ALL，极少数成熟B细胞(xbo)ALL无FABL3形态。第26页/共32页第二十六页，共33页。 T-AL

18、L：多数病例有大的FSC、SSC，在CD45SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区，多数表现为胸腺亚型，最常见亚型为皮质晚期表达，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/CD8双阳与极少膜表面CD3、TdT多为阳性。另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CD5、CD7、TdT强表达。髓质期亚型表达CD2、CD5、CD7、与CD3CD4/CD3+CD8+,很少见TdT表达。前T细胞亚型，表达CD7胞浆CD3且无其它(qt)T细胞抗原，T细胞肿瘤的特征是丧失T细胞抗原而表现出其它(qt)异常抗原组合。第27页/共32页第二十七页，共33页。 杂合型白血病：随着流式技术的广泛应用

19、，我们(w men)发现许多病例并不能严格划分为淋系或髓系，真正的双表型病人多为t(9；22)或（11q23），现在杂合型的误诊率很高。最常导致误诊的原因是在分析中未能排除非白细胞，过度强调弱的非特异性结合，忽略了某些抗体缺乏系特异性，最重要的系特异性抗原在B系、T系、髓系分别为CD22、CD3和MPO。第28页/共32页第二十八页，共33页。 慢性(mn xng)粒细胞白血病 由于慢性期显著的细胞分化，在CD45SSC图上除了(ch le)髓系细胞占主导外，只显示一个正常骨髓像，CML可确诊，CML起病与发展相对缓慢，慢性期的持续1年左右最终发展为加速期和急变期。流式细胞技术对急变期亚型的诊断具有极高价值。直接影响到治疗效果。 急变期CML主要表现为髓系，偶为淋系，髓性急变可表现出多种形态包括未分化细胞。淋性急变具典型形态特征，为CD10B祖细胞ALL极少有T细胞型ALL。第29页/共32