关于HPLC的基础知识(中文)教材

1、液相色谱液相色谱（LC）高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）分析分离手段分析分离手段色谱色谱广义概念广义概念高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱（GPC）离离 子子 色色 谱谱（IC）广义概念广义概念狭义概念、反相色谱狭义概念、反相色谱高效液相色谱基础知识高效液相色谱基础知识（HPLC Basic）HPLC基础基础1High Performance Liquid Chromatography或者或者High Pressure Liquid Chromatography 的略称的略称高效、高压液相色谱高效、高压液相色谱何为液相色谱？何为

2、液相色谱？使用使用色谱柱色谱柱进行进行液体液体/态样品态样品分析分离的手段。分析分离的手段。基础基础2 Chromatography一词中一词中Chromato的英文意思为的英文意思为色。色。 Chromatography 分析技术分析技术 Chromatograph 分析仪器分析仪器 Chromatogram 色谱图、图谱色谱图、图谱基础基础3HPLC仪器的构成仪器的构成检测器检测器泵泵脱气装置脱气装置柱温箱柱温箱进样器进样器电信号电信号数据处理系统数据处理系统基本组成基本组成 脱气装置脱气装置将洗脱液中氧气等其它气体将洗脱液中氧气等其它气体除去的装置。除去的装置。真空腔内装有特氟纶（聚四真

3、空腔内装有特氟纶（聚四氟乙烯）管，以特氟纶管作氟乙烯）管，以特氟纶管作为膜将气体除去。为膜将气体除去。常用的脱气方式有常用的脱气方式有:吹氦脱吹氦脱气法、低压脱气法、超声波气法、低压脱气法、超声波脱气法。脱气法。真空泵真空泵真空腔真空腔基本组成基本组成 脱气装置脱气装置洗脱液进入高压泵前应充分脱气，目的是：洗脱液进入高压泵前应充分脱气，目的是：1、气泡留在泵中影响泵的正常工作，使洗脱液的、气泡留在泵中影响泵的正常工作，使洗脱液的压力不稳，造成基线的噪音增加；压力不稳，造成基线的噪音增加；2、洗脱液中的氧能破坏样品，降低检测器的灵敏、洗脱液中的氧能破坏样品，降低检测器的灵敏度；度；3、当洗脱液流

4、出色谱柱进入检测器时，由于洗脱、当洗脱液流出色谱柱进入检测器时，由于洗脱液压力下降，产生气泡，影响检测器正常工作。液压力下降，产生气泡，影响检测器正常工作。基本组成基本组成 泵泵往进样器往进样器系统中的送液装置系统中的送液装置泵的重要之处：泵的重要之处： 可以在高压下使用可以在高压下使用 压力的变动小压力的变动小 以恒定的流速将洗脱液压以恒定的流速将洗脱液压送至色谱柱送至色谱柱综上所述，对泵的精度要求综上所述，对泵的精度要求是非常高的。是非常高的。泵的构造泵的构造放大放大柱塞向右运动时，上面的球柱塞向右运动时，上面的球形单向阀会向下运动；下面形单向阀会向下运动；下面的球形单向阀会向上运动。的球

5、形单向阀会向上运动。当柱塞向左运动时，球形单当柱塞向左运动时，球形单向阀的运动方向相反。向阀的运动方向相反。球形单向阀球形单向阀柱塞密封圈柱塞密封圈柱塞泵柱塞柱塞泵柱塞泵的工作原理泵的工作原理球形单向阀的内部构造球形单向阀的内部构造CartridgeSpacerCheck Valve GuideSheet PackingSheet Packing排出侧排出侧吸入侧吸入侧基本组成基本组成123654将分析对象将分析对象/样品导入样品导入色谱柱的装置。色谱柱的装置。最近，可以完成自动进样最近，可以完成自动进样的自动进样器的自动进样器/装置已成为装置已成为主流。主流。 进样器进样器泵泵色谱柱色谱柱进

6、样环进样环基本组成基本组成 柱温箱柱温箱使色谱柱保持一定温度的装置。使色谱柱保持一定温度的装置。柱压是色谱柱工作中的一个重要指标。当使用粘柱压是色谱柱工作中的一个重要指标。当使用粘度较高的洗脱液时，通过提高柱温可以降低洗脱度较高的洗脱液时，通过提高柱温可以降低洗脱液的粘度。另外，使用柱温箱可以避免由于室温液的粘度。另外，使用柱温箱可以避免由于室温改变而导致柱分离时间改变的情况发生。改变而导致柱分离时间改变的情况发生。可以说，柱温箱是高效液相色谱分析装置中的不可以说，柱温箱是高效液相色谱分析装置中的不可缺的部件。可缺的部件。基本组成基本组成检测器检测器系统中检测样品经柱分离出的各组分的装置。系统

7、中检测样品经柱分离出的各组分的装置。根据样品、感度等性质的不同，检测器可分为：根据样品、感度等性质的不同，检测器可分为：1. 紫外可见光检测器紫外可见光检测器（UV-8020）2. 示差检测器示差检测器（RI-8020、RI-8021）3. 电导率检测器电导率检测器（CM-8020）4. 电化学检测器电化学检测器（EC-8020） 其他还有荧光检测器、光散射检测器等多种检测器。其他还有荧光检测器、光散射检测器等多种检测器。紫外可见光检测器紫外可见光检测器石英杯石英杯原理与分光光度计相同原理与分光光度计相同OUT（ （ABU）log 透过光透过光吸收光吸收光Ref（透过光）（透过光）Sam（吸收

8、光）（吸收光）通常表示为：通常表示为：1ABU/1V或或Record Lens/10V光光吸収光吸収光透过光透过光UV检测池检测池示差检测器示差检测器RefSamRefSam受光部受光部利用各检测池中溶剂折射率利用各检测池中溶剂折射率差异的检测器。差异的检测器。可以识别溶剂组成上的些微可以识别溶剂组成上的些微区别。（显示为色谱峰的差区别。（显示为色谱峰的差异）异）检测两者折射率之差检测两者折射率之差通常表示为：通常表示为：25610-6RIU/1V或或Record Lens/10V基本组成基本组成数据处理装置数据处理装置根据检测器检测出的电信号进行数据计算根据检测器检测出的电信号进行数据计算/

9、处理的装置。处理的装置。过去使用描笔式记录仪进行色谱谱图的确认。现过去使用描笔式记录仪进行色谱谱图的确认。现在大都使用计算机进行数据的采集、处理分析等在大都使用计算机进行数据的采集、处理分析等工作了。工作了。分析结果举例分析结果举例Column: TSKgel ODS-100V (4.6mmI.D. x 15cmL)Eluent: 0.1% TFA in (H2O/CH3CN=99/1)Flow rate: 1.0mL/minDetector: UV (270nm)Injection vol.: 5LColumn temp.: 251: L-ascorbic acid2: nicotinami

10、de3: nicotinic acid 4: thiamine 5: pyridoxal 6: pyridoxine123456基本组成基本组成 色谱柱色谱柱FLOW进样一侧进样一侧往检测器往检测器色谱柱是样品中不同组分色谱柱是样品中不同组分得以分离的场所。得以分离的场所。色谱柱中填充有硅胶类或聚合色谱柱中填充有硅胶类或聚合物树脂类的分离介质。物树脂类的分离介质。根据填充的分离介质的不同，根据填充的分离介质的不同，色谱柱可分为反相、正相、离色谱柱可分为反相、正相、离子、离子交换、子、离子交换、分子尺寸排阻、分子尺寸排阻、亲合等多种分离模式。亲合等多种分离模式。分离原理分离原理 色谱柱色谱柱将目

11、的物将目的物/组分进行有效分离组分进行有效分离的最为重要的部件的最为重要的部件所谓色谱柱，即通常指在一根不锈钢的柱管内，所谓色谱柱，即通常指在一根不锈钢的柱管内，填充有粒径极其微小的粉末（胶体填充有粒径极其微小的粉末（胶体/凝胶）而成。凝胶）而成。分离原理分离原理HPLC色谱柱填料色谱柱填料色谱柱中填充有如左图色谱柱中填充有如左图所示的填料。所示的填料。称之为称之为GEL（凝胶体）（凝胶体）填料粒径大小为：填料粒径大小为：几几十微米（几几十微米（m）分离原理分离原理填料表面有很多凹凸不平的小孔填料表面有很多凹凸不平的小孔（几（几nm几百几百nm ）。）。这些小孔的孔径大小、填料表面这些小孔的孔

12、径大小、填料表面的表面积大小均是非常重要的参的表面积大小均是非常重要的参数。数。通常，色谱柱中填料形状为圆球通常，色谱柱中填料形状为圆球形。形。分离原理分离原理北新地日本料理日本料理四川料理四川料理卡拉卡拉OK桑拿洗浴桑拿洗浴利用上图简单说明色谱的分离原理：如图所示，在餐饮休闲娱乐一条街利用上图简单说明色谱的分离原理：如图所示，在餐饮休闲娱乐一条街的入口处，有三位男士的入口处，有三位男士A、B、C经过。经过。A不喜欢喝酒也不喜欢唱歌等休闲活动、不喜欢喝酒也不喜欢唱歌等休闲活动、B尽管不太爱喝酒却非常喜欢唱尽管不太爱喝酒却非常喜欢唱歌、歌、C既喜欢喝酒也喜欢唱歌洗浴等。可以预测，最初从这条街走出

13、的应既喜欢喝酒也喜欢唱歌洗浴等。可以预测，最初从这条街走出的应该是该是A，然后是，然后是B，最后才是，最后才是C。分离原理分离原理 整理如下整理如下餐饮休闲娱乐内容餐饮休闲娱乐内容 分离的要素分离的要素经过的男士经过的男士A、B、C 需要分离的组分需要分离的组分街道街道 柱材柱材当分离要素发生变化（如：增设游戏厅）、或当分离要素发生变化（如：增设游戏厅）、或经过客人的心情发生变化时，经过客人的心情发生变化时，A、B、C三位男三位男士的行动可能会发生改变。士的行动可能会发生改变。柱内的填料柱内的填料柱内样品柱内样品分配色谱分配色谱砂糖砂糖汽油汽油流动方向流动方向固定相（油）固定相（油）流动相流动

14、相（水）（水）离子交换色谱离子交换色谱阳离子样品阳离子样品阴离子样品阴离子样品流动方向流动方向固定相固定相流动相流动相+分子尺寸排阻色谱分子尺寸排阻色谱ABCABC123时间方向时间方向色谱柱的种类色谱柱的种类1. 反相反相/逆相色谱：逆相色谱：RPC(Reversed-phase chromatography)2. 正相正相/顺相色谱：顺相色谱：NPC(Normal phase chromatography)3. 离子交换色谱：离子交换色谱：IEC(Ion-exchange chromatography)4. 离子色谱：离子色谱：IC(Ion chromatography)色谱柱的种类色谱柱的种类5. 疏水色谱：疏水色谱：HIC(Hydrophobic interaction chromatography)6. 亲合色谱：亲合色谱：AFC(Affinity chromatography)7. 分子尺寸排阻色谱：分子尺寸排阻色谱：SEC(Size exclusion chromatography)色谱的基本用语色谱的基本用语Inj保留时间保留时间(RT)峰顶峰顶基线基线峰高（峰高（H） 半峰宽半峰宽色谱峰色谱峰 色谱的基本用语色